Современные методы диагностики и оценки эффективности лечения инфекции, вызванной Helicobacter pylori (обзор литературы)
Клиническая Лабораторная Диагностика,2002, No 8, с.41-46
А.А. Кишкун Медицинский центр Банка России, Москва
Инфекция, вызванная Helicobacter pylori (НР), имеет глобальное значение. D. Graham [49] называет ее наиболее частой инфекцией человека. Примерно 60% населения земного шара инфицировано НР [42]. В настоящее время имеются однозначные научные доказательства связи НР инфекции с хроническим гастритом, язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, злокачественными опухолями желудка - аденокарциномой и экстранодальной В-клеточной лимфомой [3, 21, 47]. Развитие и рецидивирование язвы желудка и двенадцатиперстной кишки в 99,9% случаев и хронического гастрита в 75-85% случаев связаны с HP-инфекцией [14]. Согласно данным П. Я. Григорьева и соавт. [11], в России каждый 10-й взрослый страдает тем или иным заболеванием органов пищеварения, что ставит диагностику инфицирования НР и выбор оптимальных схем лечения этой инфекции в ряд важнейших задач современной медицины.
Огромный интерес практических врачей к НР-инфекции стимулировал появление множества различных методов ее диагностики, к которым относятся следующие:
1. Бактериологические:
- обнаружение бактерий в мазках-отпечатках;
- выделение культуры НР.
2. Серологические:
- реакция связывания комплемента;
- реакция непрямой гемагглютинации;
- метод иммуноферментного анализа (ИФА);
- иммуноблоттинг;
- обнаружение НР в кале;
- обнаружение НР в слюне или транссудате десен.
3. Морфологические:
- цитологический - выявление НР в биоптате при окраске по Романовскому-Гимзе, по Граму и др.;
- гистологический.
4. Биохимические:
- уреазный тест с биоптатами;
- анализ выдыхаемого воздуха (аэротест, при котором в выдыхаемом воздухе определяется содержание 13С или 14С после принятия пациентом внутрь мочевины, предварительно меченной указанными изотопами).
5. Молекулярно-генетический:
- полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Такое большое количество методов выявления инфекции, вызываемой НР, создает определенные трудности для врачей-клиницистов и специалистов лабораторной диагностики в выборе адекватных и достоверных способов ее диагностирования. В настоящее время не определены показания к применению того или иного метода [261. Рекомендации по диагностике сводятся к постулату: "Диагностика должна быть комплексной", однако не вполне понятно, что конкретно должно входить в этот "комплекс". С нашей точки зрения, для того, чтобы выбрать определенный метод или методы выявления НР, необходимо четко и ясно определить, какие задачи стоят перед врачом-клиницистом при обнаружении у пациента связи его заболевания с НР-инфекцией. Основными задачами, стоящими перед врачом, являются следующие: 1) установление наличия или отсутствия НР; 2) в случае выявлении НР - выбор эффективной схемы лечения; 3) оценка эффективности проведенного лечения.
При выборе метода диагностики HP-инфекции лечащий врач в первую очередь должен учитывать его диагностическую чувствительность и специфичность. Между тем каждый из применяемых сегодня методов имеет свои недостатки, и поэтому ограничиваться в практической деятельности только одним методом нельзя [27|. Монодиагностика, особенно первичная, неизбежно приведет как к гипердиагностике (при серологическом исследовании сыворотки крови - вследствие перекрестного реагирования антител; при быстром уреазном тесте - из-за контаминации бактериями, обладающими уреазной активностью; при гистологическом исследовании - из-за схожести морфологии ряда микроорганизмов), так и к гиподиагностике (из-за сложностей культивирования НР или их выявления при гистохимическом исследовании в случаях низкой обсемененности; при уреазных тестах - из-за снижения уреазной активности НР в силу каких-либо причин). Следовательно, успешность выявления НР зависит от правильного сочетания разных методов диагностики. Это положение в полной мере справедливо и в отношении оценки эффективности лечения НР-инфекции.
Успешное лечение HP-инфекции во многом зависит от правильного выбора лекарственного препарата, поэтому перед началом антихеликобактерной терапии необходимо располагать сведениями о чувствительности НР к избираемому для лечения химиотерапевтическому препарату [15|. Эта проблема стала особенно актуальной в последнее время в связи с выявлением резистентности НР к ряду антибактериальных препаратов. Наибольшую тревогу у клиницистов во всем мире вызывает резистентность НР к метронидазолу, которая в различных странах находится в пределах 10-90%, и к кларитромицину (2-10%) [20, 51].
Исследования последних лет показали, что развитие гастрита и язвы желудка связано в первую очередь с колонизацией слизистой токсигенными штаммами НР, в то время как колонизация нетоксигенными штаммами только и небольшом проценте случаев приводит к развитию этих заболеваний [39, 52]. Токсигенность штаммов связана с продукцией вакуолярного цитотоксина, синтез которого в свою очередь связан с продукцией белка с мол. массой 120-128 кД, кодируемого геном Со-agA (cytoxin-associated gene А). Присутствие токсигенных штаммов является важным фактором перерождения язвы в аденокарциному [70]. Появление таких сообщений в литературе еще больше усложняет задачи, стоящие перед практическим врачом, так как в случае дальнейшего подтверждения связи язвенной болезни с токсигенными формами НР необходимо внедрять методы, способные выявлять именно такие формы НР.
Совершенно очевидно, что ни один из приведенных методов выявления НР не может одновременно решить все задачи, стоящие перед практическим врачом при лечении заболеваний, ассоциированных с НР, поэтому должен использоваться комплекс лабораторных методов.
Следовательно, такие вопросы диагностики HP-инфекций у больных с заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки, как выбор минимального комплекса лабораторных методов выявления НР, изучение роли токсигенных форм НР в патогенезе язвенной болезни, актуальны и во многом не решены.
Все существующие методы диагностики HP-инфекции можно разделить на прямые и косвенные. Прямые методы позволяют непосредственно выявить НР, косвенные методы регистрируют не саму НР, а последствия ее персистирования в организме.
Широкое распространение получил гистологический метод исследования, который позволяет одновременно с обнаружением НР проводить морфологическую оценку состояния слизистой оболочки желудка (СОЖ). Гистологический метод выявления НР считают "золотым стандартом" диагностики инфекции [2, 37, 43]. Его чувствительность составляет 72-100%, специфичность - 81-97% [60]. Это прямой метод выявления бактерий, для которого используют окраску акридиновым оранжевым, по Гимзе, по Граму, толуидиновым синим, серебрением по Warth-in-Starry и др. Впервые НР был описан в гистологических препаратах антрального отдела желудка, окрашенных именно по Warthin-Starry.
Возможность оценить состояние СОЖ, а не только определить наличие НР - огромное преимущество гистологического метода. Поставить диагноз гастрита и классифицировать выявленные изменения по Сиднейской системе, в том числе требующей определить присутствие бактерий, можно только морфологически. НР в препаратах можно оценить количественно: до 20 бактерий в поле зрения (при увеличении 630 раз) - слабая степень обсеменения; до 50 бактерий - средняя; более 50 микроорганизмов - высокая степень обсеменения.
Вместе с тем для проведения такой диагностики требуются квалифицированный персонал и морфологическая лаборатория. Существенным недостатком гистологического метода является длительный срок ожидания результатов, составляющий 5-7 дней [29].
Для цитологического исследования используют мазки-отпечатки (1-2 и более), полученные при эндоскопии из биоптатов антрального отдела СОЖ. Биоптат берут прицельно из участков с наиболее выраженными визуально отклонениями от нормы (гиперемия, отек), но не из дна или язв и эрозий [9]. Высушенные мазки окрашивают по Паппенгейму либо после фиксации метанолом смесью азура и эозина или готовым красителем Романовского-Гимзы. Приведенные методы окраски позволяют выявлять морфологические особенности строения ядер и цитоплазмы клеток слизистой оболочки, присутствие НР, ориентировочно оценивать количество микроорганизмов. Однако цитологический метод не дает полной информации о структуре исследуемой слизистой оболочки. Диагностическая чувствительность цитологического метода составляет 80-90%, специфичность - 100% [8, 22].
Предложенные способы выявления НР цитологическим методом в желудочном соке [5], полученном натощак, имеют низкие чувствительность и специфичность, поэтому в настоящее время не применяются.
Бактериологический метод позволяет культивировать НР, используя биоптаты СОЖ. Специфичность этого метода составляет 100% [2, 59], частота выделения чистой культуры НР по данным разных авторов, колеблется от 33 до 97% [1, 12, 63]. Полученные штаммы можно исследовать на предмет устойчивости к антибактериальным препаратам, которая в настоящее время представляет основную проблему лечения этой инфекции, сводя на нет усилия врачей и подрывая веру даже в многокомпонентные схемы лечения. Без бактериологического метода планировать оптимальную схему лечения пациентов с инфекцией НР нельзя, так как основная причина, снижающая процент эрадикации, - антибиотикорезистентность НР - может быть установлена в настоящее время только этим методом.
К сожалению, чувствительность бактериологического метода требует определенной оснащенности микробиологической лаборатории и квалификации ее персонала [62]. Для транспортировки и культивирования НР на питательных средах необходимы специальные условия.
Большим успехом в деле культивирования НР стало создание транспортных сред, которые позволяют продлить срок транспортировки биоптата из эндоскопического кабинета в микробиологическую лабораторию до 1 сут (среды Стюарта, Кэри-Блер, Bio-Merieux). Следующий шаг - посев биоптата на неселективные (например, агар Колумбия) и селективные среды (селективная добавка может содержать ванкомицин, триметоприм, полимиксин, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры). Инкубация посевов проводится при температуре 370С и влажности 98% в микроаэрофильных условиях в течение 3-10 сут. НР растет в атмосфере 5% кислорода, 5-10% углекислого газа, остальное количество составляет азот [28]. Для данного микроорганизма губительны как анаэробные условия, так и более высокий процент кислорода. Для создания микроаэрофильной атмосферы используют газогенераторные пакеты, которые начинают продуцировать газовые смеси после добавления в них воды. Рост культуры НР происходит, как правило, на 3-й сутки. При появлении колоний, сходных по морфологии с НР (диаметр до 0,5-2 мм, в виде "капель росы", при сплошном росте образуют прозрачную пленку), проводится их идентификация [46]. Для идентификации их окрашивают по Граму (под микроскопом при наличии НР обнаруживают грамотрицательные изогнутые палочки) и осуществляют биохимическое типирование (уреазная, каталазная, оксидазная активность, НР не ферментирует глюкозу, не продуцирует нитраты, не образует индол). Сложность и высокая стоимость выполнения бактериологического метода ограничивают его применение, несмотря на неоспоримые преимущества [21].
Были предприняты попытки культивирования НР из желудочного сока [6], однако эта методика бактериологического исследования не получила широкого распространения.
НР в процессе своей жизнедеятельности продуцирует фермент уреазу, которая накапливается в СОЖ. Уреаза разлагает мочевину до углекислого газа и ионов аммония. Для выявления уреазы, наличие которой свидетельствует о присутствии НР, предложены различные биохимические методики. В диагностические среды, обязательно включающие мочевину и индикатор, помещают гастробиоптат; если в среде начинает накапливаться аммоний - продукт гидролиза мочевины уреазой, рН среды изменяется и индикатор изменяет цвет. Уреазный тест прост в исполнении, не требует особой квалификации медицинского персонала, относительно недорогой, позволяет быстро получить ответ (в зависимости от модификации теста результат можно получить через несколько минут, самое большее через 24 ч).
В настоящее время выпускаются уреазные тесты промышленного производства: "CLO-тест", "Де-Нол-тест", "PyloriTek", "CUT-тест", "ХЕЛПИЛ-тест", "Campy-test" и др. Диагностическую среду для выявления уреазной активности НР можно изготовить в лаборатории. В российских "Рекомендациях по диагностике и лечению инфекции, вызванной Helicobacter pylori, у взрослых при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки" [33] приведена пропись уреазного теста: 2 г мочевины, 10 мл фенолрота (0,5%), 20 мг азида натрия доводят до 100 мл 0,001 М фосфатным буфером, рН 5,5. Чувствительность указанных тестов колеблется от 65 до 95%, специфичность - от 75 до 100% [18].
Предложение ряда исследователей [24, 34, 58] определять уреазную активность в желудочном соке не нашло применения в клинической практике.
Несмотря на простоту и доступность биохимического метода обнаружения НР в биоптатах СОЖ он имеет ряд существенных недостатков. Уреазные тесты дают представление о наличии НР только в одном участке СОЖ, биоптаты не годится для последующего гистологического исследования. Эти ограничения не позволяют в одном и том же участке СОЖ проводить четкую корреляцию между ее структурными изменениями и активностью уреазы. К существенным недостаткам следует отнести возможность получения ложноположительных результатов, так как показано, что у больных с патологией желудочно-кишечного тракта его верхние отделы заселяются грамотрицательными бактериями, из которых многие виды способны продуцировать уреазу, а наиболее часто встречающиеся у человека Proteus vulgaris и Proteus mirabilis способны расщеплять мочевину и те же сроки, что и НР [57].
На уреазной активности НР основаны радионуклидные методы диагностики инфекции (неинвазивные и косвенные) - это уреазные дыхательные тесты с мочевиной, меченной изотопами 13С и 14С [40]. В 1987 г. D. Graham и соавт. [48] опубликовали данные о первом методе с использованием меченной 13С мочевиной для определения Campylobacter pylori в СОЖ. Меченая мочевина дается пациенту в составе пробного завтрака. Уреаза НР разлагает мочевину до углекислого газа, сохраняющего меченый углерод. Углекислый газ с кровотоком доставляется в легкие и выводится с выдыхаемым воздухом. Пациент делает выдох в специальную пробирку-контейнер, и пробу воздуха направляют на анализ. 14С-радиоактивный изотоп, который является источником низкоэнергетических бета-частиц. Его использование имеет ряд ограничений и подчиняется строгому контролю, поэтому данный вариант менее распространен. Для регистрации приращения 14СО2 в выдыхаемом воздухе используют сцинтилляционный счетчик. Изотоп 13С не радиоактивен, может быть количественно определен с помощью газового масс-спектрометра или инфракрасного либо лазерного оборудования. Масс-спектрометры применяются наиболее широко. Поскольку для дыхательного теста не требуется проведения эзофагогастроскопии. этот метод применим у пациентов, которым она противопоказана. Дыхательный тест с изотопом 13C может быть использован для обследования детей, при эпидемиологических исследованиях больших контингентов населения. Этот тест дает представление о всей СОЖ, а не об отдельном ее фрагменте. Его чувствительность достигает 99%, а специфичность - 98% |53|. Тест выполняется в течение 45 мин. и результаты можно получить в течение 24 ч. Высокая стоимость масс-спектрометра ограничивает внедрение дыхательного теста с использованием изотопа 13C. В редких случаях дыхательный тест дает ложноположительных результаты из-за наличия других источников уреазы. Ротовая полость и глотка могут быть колонизированы уреазапродуцирующими бактериями, что и обусловливает ошибочный ответ теста [54]. Ложноотрицательные ответы теста могут быть получены, если пациент принимает антибиотики, соли висмута, а также и редких случаях на фоне приема блокаторов протонной помпы [76]. В связи с этим прием данных лекарств должен быть прекращен по крайней мере за 10 дней до проведения теста.
Агрессия НР и колонизация СОЖ вызывают системный иммунный ответ, в результате чего в крови больного появляются антитела IgA, IgM, IgG к различным бактериальным антигенам, которые могут быть выявлены серологическими методами [73].
Самым распространенным серологическим методом диагностики НР-инфекции является ИФА [40, 59]. Метод неинвазивный и косвенный, в крови больного определяют антитела к НР, относящиеся к IgA, IgM, чаще всего - к IgG. Одними из первых метод ИФА применили В. Rathbone и соавт. [67], которые использовали в качестве антигена препарат из цельных клеток НР, обработанных формалином. В дальнейшем для ИФА и качестве антигена стали применять препараты термической инактивации или ультразвуковой дезинтеграции НР. При использовании этого метода в общем титре антител наиболее ценным является определение уровней IgG- и lgA-антител к НР. Чувствительность метода колеблется от 87 до 98%, специфичность - от 75 до 100% [36, 38]. ИФА - самый подходящий метод для эпидемиологических исследований и скрининга. Его применение в клинической практике определяется индивидуально в конкретной ситуации. Пациенту, предъявляющему гастроэнтерологические жалобы, как правило, необходимо проведение эндоскопии, чтобы оценить состояние гастродуоденальной слизистой оболочки; целесообразно одновременно взять биоптаты для уреазного теста и(или) гистологического исследования, в таком случае ИФА не понадобится [21]. Простое качественное определение антител к НР методом ИФА для диагностики инфекции больших перспектив не имеет. Однако в последние годы были получены диагностические тест-системы на базе ИФА, которые обладают высокой чувствительностью и позволяют количественно определять антитела к НР различных классов [17]. Итальянские исследователи D. Vaira и соавт. [72], используя такие тест-системы, разработали стратегию скрининга НР-инфекции, которая дала обнадеживающие результаты и может быть использована для оценки эффективности эрадикации при исследовании титра антител в динамике.
В настоящее время в распоряжении специалистов клинической лабораторной диагностики имеются диагностические наборы для серологического анализа, которые позволяют оценивать патогенность штаммов НР. Такие штаммы характеризуются наличием CagA-гена, продуцируют цитотоксинассоциированный белок и чаше обнаруживаются у больных язвенной болезнью и раком желудка. Метод ИФА позволяет обнаружить антитела к цитотоксинассоциированному белку в сыворотке крови больных. Диагностическая чувствительность тест-систем для обнаружения антител к CagA-белку НР составляет 90-100%, специфичность - 76-94% [41].
Преимуществом метода ИФА является меньшая травматичность по сравнению со всеми другими методами, где нужно получение биоптата СОЖ. Кроме того, для анализа требуется несколько микролитров сыворотки, в оборудованной лаборатории можно одновременно выполнить десятки исследований и получить результаты в короткие сроки (2,5-3 ч).
Одним из серологических методов диагностики НР-инфекции, обладающим высокой специфичностью, является Western-blot - встречная преципитация в геле антител в сыворотке крови больного с различными белками НР, меченными зондами, подвергнутыми разделению по молекулярной массе с помощью электрофореза и нанесенными на нитроцеллюлозу. С помощью данного метода штаммы НР в настоящее время подразделяют на 4 серотипа в зависимости от выработки микроорганизмами цитотоксина VacA и цитотоксинассоциированного белка CagA: тип I (CagA+, VacA+), тип Iа (CagA+, VacA-), тип Ib (CagA-, VacA+), тип II (CagA-, VacA-) [65]. В своих исследованиях М. Plebani и соавт. [64], В. Д. Пасечников и соавт. [31] показали, что инфицирование CagA-позитивными (серотип Iа) штаммами НР является фактором риска развития выраженного воспалительного ответа в СОЖ. Определение типа штаммов НР у инфицированных имеет важное прогностическое значение. Л. И. Аруин [4], J. Rudi и соавт. [68] приводят данные о том, что пациенты с выявленными у них штаммами CagA+ HP в значительно большей степени подвержены риску развития язвенной болезни и рака желудка, чем инфицированные штаммами CagA.
Недавно разработаны качественные тесты для определения антител к НР, которые можно выполнить "у постели больного". Они основаны на латекс-агглютинации или твердофазном ИФА и выявляют lgA-антитела к НР. Для проведения исследования нужна капля крови, взятой из пальца, результат считывается буквально через несколько минут, никаких дополнительных реактивов не требуется. Диагностическая чувствительности таких тестов составляет 94%. специфичность - 98% [19]. Благодаря уникальной простоте выполнения эти методы незаменимы в небольших больницах или амбулаториях, где потребность в диагностике определяется единичными анализами или в кабинете семейного врача. В 1998 г. появились тест-системы для количественного определения антигена НР в фекалиях больных методом ИФА [25], которые имеют большие перспективы. Диагностическая чувствительность,таких методов в отношении выявления НР составляет 88,9%. специфичность - 94,6% [55].
Современные подходы к диагностике HP-инфекции включают молекулярно-генетические методы исследования, которые представляют собой различные модификации, с обнаружением генетического материала, специфического для рода Helicobacter (16S-pPHK) и вида НР (гены UreA, UreB, Cag, Vac, ice и др.) [30, 40, 66].
ПЦР используется для амплификации ДНК и позволяет в считанные часы размножить in vitro специфический участок ДНК (т. е. любой интересующий нас ген) более чем и 200.000 раз. Чтобы провести реакцию, достаточно иметь ДНК-материал I клетки; количество амплифицированной с помощью ПЦР ДНК столь велико, что эту ДНК можно просто окрашивать. Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК для правильного подбора искусственно синтезированных праймеров [61].
Уникальность метода ПЦР состоит не только в высокой чувствительности и специфичности для выявления НР. но и в том, что материалом для него служат и биоптаты СОЖ, и желудочный сок, и смывы ротовой полости, и зубной налет, и копрофильтраты [35, 69, 71]. Диагностическая чувствительность ПЦР для выявления НР в биоптатах СОЖ составляет 88-95,4%, специфичность - 100% [45, 74|; в копрофильтратах - соответственно 61,4-93,7 и 100% [55, 75].
Несмотря на то что проблема выявления НР неоднократно освещалась в медицинской литературе, разворачиваются новые дискуссии о том, у кого следует проводить выявление бактерий и какими методами это делать. Чтобы помочь практикующим врачам разобраться в большом количестве методов диагностики HP-инфекции и выбрать необходимые, российской группой ученых по изучению НР в 1997 г. были разработаны "Рекомендации по диагностике и лечению инфекции, вызванной Helicobacter pylori, у взрослых при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки" [33]. Принципиальное значение для практики имеет разделение методики выявления НР до лечения (т. е. обнаружение инфекции для обоснованного назначения лечения) и после проведения эрадикационной терапии (для контроля успешности антибактериальной схемы).
Согласно рекомендациям, первичная диагностика необходима у тех больных, которым планируется антихеликобактерная терапия. Чтобы начать лечение, достаточно подтвердить наличие бактерий одним из нижеперечисленных методов.
1. Бактериологический посев биоптата СОЖ на дифференциально-диагностическую среду.
2. Морфологические методы: "золотой стандарт" диагностики HP-инфекции, окраска бактерии в гистологическом препарате СОЖ по Гимзе, толуодиновым синим, Warthin-Starry, Генте; цитологический метод: окраска бактерий в мазках-отпечатках биоптатов СОЖ по Гимзе, Граму.
3. Дыхательный метод: определение в выдыхаемом больным воздухе изотопа 14С или 13С; изотоп выделяется в результате расщепления в желудке больного меченой мочевины под действием уреазы НР.
4. Уреазный метод: определение уреазной активности в биоптате СОЖ путем помещения его в жидкую или гелеобразную среду, содержащую субстрат, буфер и индикатор.
В настоящее время существует большое количество терапевтических схем лечения НР-инфекции, однако оптимальная терапия пока не разработана. В отечественной научной литературе для обозначения лечения в отношении НР широкое распространение получил и "прижился" английский термин "эрадикация". Эрадикация - это полное уничтожение НР как вегетативной, так и кокковидной формы в желудке и двенадцатиперстной кишке больного [33].
Основой лечения HP-инфекции является использование схем комбинированной трехкомпонентной терапии, которые включают: коллоидный субцитрат висмута + тетрациклин + метронидазол (или тинидазол); омепразол (или пантопразол) + кларитромицин + метронидазол; омепразол (или пантопразол) + амоксициллин + кларитромицин. Комбинация 4 лекарственных препаратов - квадротерапия (омепразол + коллоидный субцитрат висмута + тетрациклин + метронидазол) рассматривается как терапия резерва. Ее эффективность в отношении НР оценивается как максимальная.
Эрадикационная терапия не всегда оказывается успешной. Для ведущих научных центров эрадикация НР выше 80% является отличным показателем эффективности терапии [10].
Одной из главных причин низкой эффективности схем антихеликобактерной терапии является резистентность штаммов НР к антибактериальным препаратам, которые входят в эти схемы. Согласно данным Л. В. Кудрявцевой и соавт. [20], резистентность штаммов НР у взрослого городского населения России увеличилась за период с 1996 по 1998 г.: к метронидазолу с 36,1 до 56,9%; к кларитромицину с 0 до 14,4%; растет также число штаммов с полирезистентностью (6%). В Москве уровень резистентности штаммов НР к метронидазолу составляет 56,6%, к кларитромицину - 16,6%.
Маастрихтские рекомендации указывают на то, что исследование чувствительности НР к антибактериальным препаратам при первом назначении не обязательно [56]. Назначение схемы лечения в таком случае должно основываться на эпидемиологических данных и показателе распространенности резистентности в конкретной стране, еще лучше - в регионе. В настоящее время признано, что при распространенности резистентности к кларитромицину менее 15%, а к метронидазолу менее 30% все еще возможно применять эти препараты [29]. В связи с тем что данные о резистентности к антибактериальным препаратам значительно превышают приведенные показатели, все больше исследователей считают необходимым определение чувствительности перед проведением лечения [46]. Это значительно повышает значимость бактериологического метода.
Диагностика эрадикации, т. е. контроль успешности проведения антибактериального лечения, является одной из важнейших проблем и требует особых подходов. В "Рекомендациях по диагностике и лечению инфекции, вызванной Helicobacter pylon, у взрослых при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки" [33] определены следующие требования для диагностики эрадикации.
1. Диагностика эрадикации должна осуществляться не ранее чем через 4-6 нед после окончания курса антихеликобактерной терапии либо окончания лечения сопутствующих заболеваний любыми антибиотиками или антисекреторными средствами.
2. Диагностика эрадикации осуществляется как минимум двумя из указанных диагностических методов, причем при использовании методов непосредственного обнаружения бактерий в биоптате СОЖ (бактериологический, морфологический, уреазный) необходимо исследование 2 биоптатов из тела желудка и 1 биоптата из антрального отдела.
3. Цитологический метод для установления эрадикации неприменим.
В настоящее время дыхательный тест с мочевиной, меченной изотопом 13С, считается наилучшим методом оценки эффективности эрадикационной терапии [32]. P. Johnson и соавт. [50] на большом клиническом материале изучили эффективность дыхательного теста методом масс-спектрометрии в оценке эффективности эрадикации. Было показано, что уже через 4 нед после лечения отмечается снижение содержания 13СО2 в выдыхаемом воздухе при эффективном лечении. В. Т. Ивашкин и соавт. [16] в своих исследованиях показали, что проведение дыхательного теста с использованием лазерного метода до терапии и через 4 и 12 нед после курса терапии позволяет оценивать эффективность применения различных схем лечения. У 50% пациентов уже через 4 нед после лечения наблюдали значительное снижение концентрации 13С (с 25-100 до 5 промилле) в выдыхаемом воздухе, что свидетельствовало о подавлении колонии НР. Через 12 нед после курса терапии у части пациентов наблюдается восстановление колоний НР, соответственно число больных с низкими значениями концентрации 13C, свидетельствующими об отсутствии инфицированности, снижалось до 35%. Большинство исследователей сходятся во мнении, что окончательное суждение об эффективности эрадикации НР с помощью дыхательного теста можно сделать не ранее чем через 4 нед после курса лечения.
Определение в сыворотке крови специфических IgA-, IgM-и IgG-антител к НР активно используется для скрининга и первичной диагностики инфекции. Однако существует ряд ограничений, затрудняющих применение серологических методов для контроля за лечением инфекции. Одно из наиболее важных ограничений связано с тем, что концентрация специфических антител к НР снижается в крови пациентов и при успешной терапии, и при персистировании инфекции. При этом, по данным разных авторов, снижение титра происходит в сроки от 3 до 6 мес, а иногда до 24 мес после лечения [46]. В связи с этим качественная серологическая диагностика для контроля эффективности терапии HP-инфекции не может быть рекомендована. Наличие антител к НР в крови однозначно не свидетельствует о присутствии активной инфекции в СОЖ и может иметь следовой характер. Только в том случае, если использована количественная методика ИФА и есть возможность сравнить уровень антител после лечения с исходным их уровнем, можно сделать определенные выводы. Информативным считается более чем 50% падение титра антител в анализе, взятом через 6 мес после окончания курса антихеликобактерной терапии [40]. Полугодовое ожидание для определения результата лечения, трудность организации взятия и хранения двух проб крови, меньшая доступность количественных методик ИФА по сравнению с качественными не позволяли рекомендовать этот метод для контроля эрадикации инфекции [21].
Диагностические тест-системы нового поколения на базе ИФА обладают высокой чувствительностью и позволяют количественно определять антитела различных классов НР, что активно используется для оценки эффективности лечения. A. Cutler и V. Prasad [44], G. Perez-Perez и соавт. [63], используя такие тест-системы, разработали стратегию применения серологических тестов для оценки эрадикации, которая дала обнадеживающие результаты. В сравнении с инвазивными методами (гистологический, уреазный) было показано, что если через 30-40 дней после лечения титр IgG-антитсл уменьшился на 20% и более, можно считать, что в результате лечения наступила эрадикация НР; если значение титра повышается, не изменяется или его уменьшение составляет менее 20%, это необходимо расценивать как отсутствие эрадикации. Аналогичные результаты были получены отечественными исследователями [13].
Метод ИФА с количественным определением антигена НР в фекалиях находит все большее применение для оценки эффективности эрадикации. Мультицентровое исследование в странах Европейского союза, проведенное более чем у 400 больных, подтвердило его высокую эффективность в оценке эрадикации в сравнении с инвазивными методиками и дыхательным тестом [I7]. Стоимость I анализа пока остается на уровне стоимости дыхательного теста.
В арсенале тестов для оценки эффективности лечения НР-инфекции имеется также ПЦР, которая остается наиболее информативной [11]. ПЦР для выявления уреазного гена НР в биологическом материале применяется довольно давно в качестве контрольного метода в научных исследованиях, однако оптимизация методики привела к ее существенному удешевлению и возможности использования в клинической практике. Ряд авторов считают ПЦР наиболее чувствительным методом оценки эрадикации в ранние сроки после лечения [55, 77].
Сроки в 4-6 нед для оценки эффективности эрадикации ряд авторов обосновывают тем, что применение антибактериальных препаратов резко снижает количество НР в СОЖ, поэтому сразу после окончания лечения даже в случае его неудачи НР не обнаруживается. Ложноотрицательные результаты обусловлены тем, что НР может отсутствовать в случайно взятых единичных биоптатах СОЖ или находиться там в таких незначительных количествах, которые не обнаруживаются используемыми диагностическими методами (гистологический, уреазный, бактериологический). В реальной практике это приводит к тому, что пациенты в случае неэффективного лечения выписываются из стационара и не обращаются к врачу до следующего обострения заболевания. В связи с этим оценить эффективность эрадикации в сроки позже 4-6 нед практически очень сложно.
Таким образом, необходимо продолжать поиск и внедрение в клиническую практику новых методов диагностики НР-инфекции и оценки эффективности ее лечения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аруин Л. И., Смотрова И. А., Ильченко А. А. // Арх. пат. - 1988. - N 2. - С. 13-18.
2. Аруин Л. И., Григорьев П. Я., Исаков В. А., Яковенко Э. П. Хронический гастрит. - Амстердам, 1993.
3. Аруин Л. И., Исаков В. А. // Арх. пат. - 1995. - Т. 57, N 3. - С. 75-76.
4. Аруин Л. И. // Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori: 2-й Международный симпозиум "Современные проблемы физиологии и патологии пищеварения". - М., 1999. - С. 33-37.
5. Баженов Л. Г., Ходжаева Н. У., Садыков Р. А., Саидханов Б. А, II Клин. лаб. диагн. - 1993. - N 5. - С. 19-22.
6. Баженов Л. Г., Перепелова И. Н. // Журн. микробиол. - 1997.-N 3.- С. 100-101.
7. Говорунов В. М., Гущин А. Е., Исаков В. А. и др. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2000. - Т. 10, N 2.-С. 12-15.
8. Гребенев А. Л., Лапина Т. Л., Склянская С. А. и др. // Клин. лаб. диагн. - 1995. - N 6. - С. 104-105.
9. Григорьев П. Я., Яковенко Э. П. // Рос. мед. журн. - 1996. - N 6. - С. 56-59.
10. Григорьев П. Я., Яковенко Э. П. // Рос. гастроэнтерол. журн. - 1997. - N 2. - С. 31-35.
11. Григорьев П. Я., Жуховицкий В. Г., Яковенко Э. П., Яковенко А. В. II Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1998. - Т. 8, N8 4. - С. 6-9.
12. Диагностика и лечение кампилобактериальных поражений желудка и двенадцатиперстной кишки: Метод. рекомендации / Логинов А. С., Аруин Л. И., Ильченко А. А., Жуховицкий В. Г. - М., 1988.
13. Дурова О. М., Исаков В. А., Иваненко Т. В. и др. // Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori: 2-й Международный симпозиум "Современные проблемы физиологии и патологии пищеварения". - М., 1999. - С. 60-63.
14. Ивашкин В. Т., Лапина Т. Л. // Диагностика и лечение. - 1996. -N 11. - С. 3-10.
15. Ивашкин В. Т. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1997. - Т. 7. N 1. - С. 21-23.
16. Ивашкин В. Т., Никитина Е. И., Степанов Е. В. и др. // Там же. - 1999. - Т. 9, N 2. - С.53-60.
17. Исаков В. А. // Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori: 2-й Международный симпозиум "Современные проблемы физиологии и патологии пищеварения". - М., 1999. - С. 12-15.
18. Корниенко Е. А., Милейко В. Е. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол.,- колопроктол. - 1988. - Т. 8, N 6. - С. 34-38.
19. Кудрявцева Л. В.. Минаев В. И. // Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori: 2-й Международный симпозиум "Современные проблемы физиологии и патологии пищеварения". - М., 1998. - С. 4.
20. Кудрявцева Л. В., Довгаль С. Г., Щербаков П. Л., Иваников И. О. II Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2000. - Т. 10, N 2, Прил. N 10. - С. 41.
21. Лапина Т. Л. // Там же. - 1999. - Т. 9, N 2. - С. 41-45.
22. Логинов А. С., Аруин Л. И., Ильченко А. А. Язвенная болезнь и Helicobacter pylori. Новые аспекты патогенетической терапии. - М., 1993.
23. Маркова Г. А., Бошнаков Р. X., Петров П. К. и др. // Мол. генетика. - 1994. - N 1. - С. 10-15.
24. Москвич Ц. Г., Соколовский В. В., Пак С. Ф. // Клин. мед. - 1989. - Т. 67, N 1. - С. 80-81.
25. Мегро Ф. // Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori: 2-й Международный симпозиум "Современные проблемы физиологии и патологии пищеварения". - М., 1998. - С. 1.
26. Минушкин О. Н., Васильева Н. Ю., Минаев В. И. и др. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1997. - Т. 7, N 4. -С. 6-10.
27. Минушкин О. Н., Васильева Н. Ю. // Кремлев. медицина. - 1998. - N 2. - С. 9-И.
28. Митрохина Т. В., Фитилев С. Б., Графская Н.Д., Павлова М. В. // Хирургия. - 1996. - N 2. - С. 39-42.
29. Морозов И. А. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1999. - Т. 9, N 2. - С. 46-48.
30. Пасечников В. Д., Чуков С. 3., Правдина И. А. и др. // Там же. - 1998. - Т. 8, N 4. - С. 28-31.
31. Пасечников В. Д., Чуков С. 3., Правдина И. А. Там. же. - 2000. - Т. 10, N 2. - С. 63-65.
32. Пахарес-Гарсиа X. М. // Там же. - 1999. - Т. 9, N 2. - С. 48-52.
33. Рекомендации по диагностике и лечению инфекции Helicobacter pylori у взрослых при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки // Там. же. - 1998. - Т. 8, N 1. - С. 105-107.
34. Рожавин М. А., Сорлогуб В. В., Микитюк И. Б. // Журн. микробиол. - 1989. - N 1. - С. 111 - 112.
35. Семин С. Г., Щербаков П. Л., Шипулин Г. Ф. и др. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2000. - Т. 10, N 2. - С. 82-83.
36. Серебрянская М. В. // Клин. мед. - 1994. - Т. 72, N 6. - С. 40-42.
37. Склянская О. А., Лапина Т. Л., Мягкова Л. П. и др. // Развитие идей академика В. X. Василенко в современной гастроэнтерологии: К 96-летию со дня рождения. - М., 1993. - Т. 2. - С. 85-87.
38. Чайка Н. А., Хазенсон Л. Б., Бутилер Ж. П. Кампилобактериоз. - М., 1988.
39. Atherton J. С., Peek R. М., Тhат К. Т. et al. // Am. J. Gastroenterol. - 1994. - Vol. 89. - P. 1322.
40. Atherton J. C. // Aliment. Pharmacol. Ther. - 1997. - Vol. 11. - Suppl. I. - P. 11-20.
41. Basso D., Stefani A., Brigato L. et al. // J. Clin. Lab. Anal. - 1999. - Vol. 13, N 4. - P. 194-198.
42. Cave D. Y. // Gastrocnterology. - 1997. - Vol. 113. - Sup-pi. I. - P. 48-51.
43. Cohen H., Laine L. // Aliment. Pharmacol. Ther. - 1997. - Vol. 11.- Suppl. I. - P. 3-9.
44. Cutler A., Prasad V. // Am. J. Gastroenterol. - 1996. - Vol. 91. - P. 85-88.
45. Germani Y., Dauga C., Duvat P. et al. // Res. Microbiol. - 1997. - Vol. 148, N 4. - P. 315-326.
46. Glupczynski Y. // Acta Gastroenterol. Belg. - 1998. - Vol.61.- P. 321-326.
47. Go M. F., Cissell L, Graham D. Y. // Scand. J. Gastroenterol. - 1998.-Vol. 33. - P. 132-137.
48. Graham D. Y., Klein P. D., Evans D. J. et al. // Lancet. -1987. - Vol. 1, N 8543. - P. 1174-1177.
49. Graham D. Y. // Gastroenterology. - 1997. - Vol. 113. - Suppl. - P. 48-51.
51. Lee A., Megraud F. // Helicobacter Pylori: Techniques for Clinical Diagnosis and Basic research / Print. - London, 1996.
52. Mellgard В., Helander H. // Scand. J. Gastroentcrol. - 1997. - Vol. 32. - P. 439-444.
53. Logan R. P. H. // Helicobacter pylori and Gastroduodenal Disease / Eds B. J. Rathbone, V. R. Heartley. - 2-nd Ed. -Oxford, 1992. - P. 88-107.
54. Logan R. P. H. // Helicobacter Pylori Techniques for Clinical Diagnosis and Basic Research. - London, 1996. - P. 74-83.
55. Makristathis A., Pasching E., Schetze K. et al. // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36. N 9. - P. 2772-2774.
56. Malfertheiner P., Megraund F., O"Morain C. et al. // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. - 1997. - Vol. 9, Pt. I. - P. 2.
57. Marshall B. J., Warren J. R. // Lancet. - 1984. - Vol. 1, N 8390. - P. 1311-1311.
58. Marshall B. J. // Hosp. Pract. - 1987. - Vol. 22, N 8. -P. 87-96.
59. Megraud F. // Gastroenterology. - 1997. - Vol. 113. - Sup-pi. - P. 593-598.
60. Montogomeri E. A., Martin D. F. Peura D. A. // Am. J. Clin. Pathol. - 1988. - Vol. 90, N 5. - P. 606-609.
61. Oksanen K., Kainulainen H., Ruuska T. et al. // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. - 1999. - Vol. 28, N 3. - P. 252-256.
62. Pajares Garcha J. M. // Ital. J. Gastroenterol. Hepatol. - 1988. - Vol. 30. - Suppl. 3. - P. 320-323.
63. Perez-Perez G. /., Dworkin B. M., Chodos J. E. et al. // Ann. Intern, med. - 1988. - Vol. 190, N 1. - P. 11-17.
64. Plebani M., Guariso G., Fogar P. et al. // Helicobacter. - 1999. - Vol. 4, N 4. - P. 226-232.
65. Purk S. M., Hong S. /., Jung H. Y. et al. // X EHPSG International Workshop: Abstracts-On-Disk, 1997.
66. Pappuoli R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1993. - Vol. 90. - P. 5791-5795.
67. Rathbone B. J.. Wyatt J. I., Heatley R. V. // Gut. - 1956. - Vol. 27, N 6. - P. 635-641.
68. Rudi J., Rudy A., Maiwald M. et al. // Am. J. Gastroenterol. - 1999. - Vol. 94, N 6. - P. 1525-1531.
69. Schwurz E., Plum G., Mauff G. et al. // Z. Bakteriol. - 1997. - Bd. 285, N 3, - S. 368-378.
70. Shimoyama Т.. Fukuda S., Tanaka M. et al. // J. Clin. Pathol. - 1998. - Vol. 51, N 3. - P. 225-228.
71. Song Q., Halter В., Schmid R. M. et al. // Dig. Dis. Sci. - 1999. - Vol. 44, N 3. - P. 479-484.
72. Vaira D., Slanghellini V., Menegalti M. et al. // Endoscopy. - 1997. - Vol. 29, N 7. - P. 595-601.
73. Vaira D., Holton J., Menegatti M. et al. //Gut. - 1999. - Vol. 45. - Suppl. 1. - P. 123-127.
74. Van der Wouden E. J., Thijs J. C., van Zwet A. A. et al. // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. - 1999. - Vol. 11, N 11. - P. 1255-1258.
75. Watanabe Т., Tomita S., Kudo M. et al. // Scand. J. Gastroenterol. - 1998. - Vol. 33. N 11. - P. 1140-1143.
76. Weil J., Bell G. D., Powell K. et al. // Aliment. Pharmacol. Ther. - 1991. - Vol. 5. - P. 309-313.
77. Yamamura F., Yoshikawa N., Akita Y. et al. //J. Gastroenterol.- 1999. - Vol. 34, N 4. - P. 461-466.
© Copyright AMA Ltd. 2004.
Огромный интерес практических врачей к НР-инфекции стимулировал появление множества различных методов ее диагностики, к которым относятся следующие:
1. Бактериологические:
- обнаружение бактерий в мазках-отпечатках;
- выделение культуры НР.
2. Серологические:
- реакция связывания комплемента;
- реакция непрямой гемагглютинации;
- метод иммуноферментного анализа (ИФА);
- иммуноблоттинг;
- обнаружение НР в кале;
- обнаружение НР в слюне или транссудате десен.
3. Морфологические:
- цитологический - выявление НР в биоптате при окраске по Романовскому-Гимзе, по Граму и др.;
- гистологический.
4. Биохимические:
- уреазный тест с биоптатами;
- анализ выдыхаемого воздуха (аэротест, при котором в выдыхаемом воздухе определяется содержание 13С или 14С после принятия пациентом внутрь мочевины, предварительно меченной указанными изотопами).
5. Молекулярно-генетический:
- полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Такое большое количество методов выявления инфекции, вызываемой НР, создает определенные трудности для врачей-клиницистов и специалистов лабораторной диагностики в выборе адекватных и достоверных способов ее диагностирования. В настоящее время не определены показания к применению того или иного метода [261. Рекомендации по диагностике сводятся к постулату: "Диагностика должна быть комплексной", однако не вполне понятно, что конкретно должно входить в этот "комплекс". С нашей точки зрения, для того, чтобы выбрать определенный метод или методы выявления НР, необходимо четко и ясно определить, какие задачи стоят перед врачом-клиницистом при обнаружении у пациента связи его заболевания с НР-инфекцией. Основными задачами, стоящими перед врачом, являются следующие: 1) установление наличия или отсутствия НР; 2) в случае выявлении НР - выбор эффективной схемы лечения; 3) оценка эффективности проведенного лечения.
При выборе метода диагностики HP-инфекции лечащий врач в первую очередь должен учитывать его диагностическую чувствительность и специфичность. Между тем каждый из применяемых сегодня методов имеет свои недостатки, и поэтому ограничиваться в практической деятельности только одним методом нельзя [27|. Монодиагностика, особенно первичная, неизбежно приведет как к гипердиагностике (при серологическом исследовании сыворотки крови - вследствие перекрестного реагирования антител; при быстром уреазном тесте - из-за контаминации бактериями, обладающими уреазной активностью; при гистологическом исследовании - из-за схожести морфологии ряда микроорганизмов), так и к гиподиагностике (из-за сложностей культивирования НР или их выявления при гистохимическом исследовании в случаях низкой обсемененности; при уреазных тестах - из-за снижения уреазной активности НР в силу каких-либо причин). Следовательно, успешность выявления НР зависит от правильного сочетания разных методов диагностики. Это положение в полной мере справедливо и в отношении оценки эффективности лечения НР-инфекции.
Успешное лечение HP-инфекции во многом зависит от правильного выбора лекарственного препарата, поэтому перед началом антихеликобактерной терапии необходимо располагать сведениями о чувствительности НР к избираемому для лечения химиотерапевтическому препарату [15|. Эта проблема стала особенно актуальной в последнее время в связи с выявлением резистентности НР к ряду антибактериальных препаратов. Наибольшую тревогу у клиницистов во всем мире вызывает резистентность НР к метронидазолу, которая в различных странах находится в пределах 10-90%, и к кларитромицину (2-10%) [20, 51].
Исследования последних лет показали, что развитие гастрита и язвы желудка связано в первую очередь с колонизацией слизистой токсигенными штаммами НР, в то время как колонизация нетоксигенными штаммами только и небольшом проценте случаев приводит к развитию этих заболеваний [39, 52]. Токсигенность штаммов связана с продукцией вакуолярного цитотоксина, синтез которого в свою очередь связан с продукцией белка с мол. массой 120-128 кД, кодируемого геном Со-agA (cytoxin-associated gene А). Присутствие токсигенных штаммов является важным фактором перерождения язвы в аденокарциному [70]. Появление таких сообщений в литературе еще больше усложняет задачи, стоящие перед практическим врачом, так как в случае дальнейшего подтверждения связи язвенной болезни с токсигенными формами НР необходимо внедрять методы, способные выявлять именно такие формы НР.
Совершенно очевидно, что ни один из приведенных методов выявления НР не может одновременно решить все задачи, стоящие перед практическим врачом при лечении заболеваний, ассоциированных с НР, поэтому должен использоваться комплекс лабораторных методов.
Следовательно, такие вопросы диагностики HP-инфекций у больных с заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки, как выбор минимального комплекса лабораторных методов выявления НР, изучение роли токсигенных форм НР в патогенезе язвенной болезни, актуальны и во многом не решены.
Все существующие методы диагностики HP-инфекции можно разделить на прямые и косвенные. Прямые методы позволяют непосредственно выявить НР, косвенные методы регистрируют не саму НР, а последствия ее персистирования в организме.
Широкое распространение получил гистологический метод исследования, который позволяет одновременно с обнаружением НР проводить морфологическую оценку состояния слизистой оболочки желудка (СОЖ). Гистологический метод выявления НР считают "золотым стандартом" диагностики инфекции [2, 37, 43]. Его чувствительность составляет 72-100%, специфичность - 81-97% [60]. Это прямой метод выявления бактерий, для которого используют окраску акридиновым оранжевым, по Гимзе, по Граму, толуидиновым синим, серебрением по Warth-in-Starry и др. Впервые НР был описан в гистологических препаратах антрального отдела желудка, окрашенных именно по Warthin-Starry.
Возможность оценить состояние СОЖ, а не только определить наличие НР - огромное преимущество гистологического метода. Поставить диагноз гастрита и классифицировать выявленные изменения по Сиднейской системе, в том числе требующей определить присутствие бактерий, можно только морфологически. НР в препаратах можно оценить количественно: до 20 бактерий в поле зрения (при увеличении 630 раз) - слабая степень обсеменения; до 50 бактерий - средняя; более 50 микроорганизмов - высокая степень обсеменения.
Вместе с тем для проведения такой диагностики требуются квалифицированный персонал и морфологическая лаборатория. Существенным недостатком гистологического метода является длительный срок ожидания результатов, составляющий 5-7 дней [29].
Для цитологического исследования используют мазки-отпечатки (1-2 и более), полученные при эндоскопии из биоптатов антрального отдела СОЖ. Биоптат берут прицельно из участков с наиболее выраженными визуально отклонениями от нормы (гиперемия, отек), но не из дна или язв и эрозий [9]. Высушенные мазки окрашивают по Паппенгейму либо после фиксации метанолом смесью азура и эозина или готовым красителем Романовского-Гимзы. Приведенные методы окраски позволяют выявлять морфологические особенности строения ядер и цитоплазмы клеток слизистой оболочки, присутствие НР, ориентировочно оценивать количество микроорганизмов. Однако цитологический метод не дает полной информации о структуре исследуемой слизистой оболочки. Диагностическая чувствительность цитологического метода составляет 80-90%, специфичность - 100% [8, 22].
Предложенные способы выявления НР цитологическим методом в желудочном соке [5], полученном натощак, имеют низкие чувствительность и специфичность, поэтому в настоящее время не применяются.
Бактериологический метод позволяет культивировать НР, используя биоптаты СОЖ. Специфичность этого метода составляет 100% [2, 59], частота выделения чистой культуры НР по данным разных авторов, колеблется от 33 до 97% [1, 12, 63]. Полученные штаммы можно исследовать на предмет устойчивости к антибактериальным препаратам, которая в настоящее время представляет основную проблему лечения этой инфекции, сводя на нет усилия врачей и подрывая веру даже в многокомпонентные схемы лечения. Без бактериологического метода планировать оптимальную схему лечения пациентов с инфекцией НР нельзя, так как основная причина, снижающая процент эрадикации, - антибиотикорезистентность НР - может быть установлена в настоящее время только этим методом.
К сожалению, чувствительность бактериологического метода требует определенной оснащенности микробиологической лаборатории и квалификации ее персонала [62]. Для транспортировки и культивирования НР на питательных средах необходимы специальные условия.
Большим успехом в деле культивирования НР стало создание транспортных сред, которые позволяют продлить срок транспортировки биоптата из эндоскопического кабинета в микробиологическую лабораторию до 1 сут (среды Стюарта, Кэри-Блер, Bio-Merieux). Следующий шаг - посев биоптата на неселективные (например, агар Колумбия) и селективные среды (селективная добавка может содержать ванкомицин, триметоприм, полимиксин, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры). Инкубация посевов проводится при температуре 370С и влажности 98% в микроаэрофильных условиях в течение 3-10 сут. НР растет в атмосфере 5% кислорода, 5-10% углекислого газа, остальное количество составляет азот [28]. Для данного микроорганизма губительны как анаэробные условия, так и более высокий процент кислорода. Для создания микроаэрофильной атмосферы используют газогенераторные пакеты, которые начинают продуцировать газовые смеси после добавления в них воды. Рост культуры НР происходит, как правило, на 3-й сутки. При появлении колоний, сходных по морфологии с НР (диаметр до 0,5-2 мм, в виде "капель росы", при сплошном росте образуют прозрачную пленку), проводится их идентификация [46]. Для идентификации их окрашивают по Граму (под микроскопом при наличии НР обнаруживают грамотрицательные изогнутые палочки) и осуществляют биохимическое типирование (уреазная, каталазная, оксидазная активность, НР не ферментирует глюкозу, не продуцирует нитраты, не образует индол). Сложность и высокая стоимость выполнения бактериологического метода ограничивают его применение, несмотря на неоспоримые преимущества [21].
Были предприняты попытки культивирования НР из желудочного сока [6], однако эта методика бактериологического исследования не получила широкого распространения.
НР в процессе своей жизнедеятельности продуцирует фермент уреазу, которая накапливается в СОЖ. Уреаза разлагает мочевину до углекислого газа и ионов аммония. Для выявления уреазы, наличие которой свидетельствует о присутствии НР, предложены различные биохимические методики. В диагностические среды, обязательно включающие мочевину и индикатор, помещают гастробиоптат; если в среде начинает накапливаться аммоний - продукт гидролиза мочевины уреазой, рН среды изменяется и индикатор изменяет цвет. Уреазный тест прост в исполнении, не требует особой квалификации медицинского персонала, относительно недорогой, позволяет быстро получить ответ (в зависимости от модификации теста результат можно получить через несколько минут, самое большее через 24 ч).
В настоящее время выпускаются уреазные тесты промышленного производства: "CLO-тест", "Де-Нол-тест", "PyloriTek", "CUT-тест", "ХЕЛПИЛ-тест", "Campy-test" и др. Диагностическую среду для выявления уреазной активности НР можно изготовить в лаборатории. В российских "Рекомендациях по диагностике и лечению инфекции, вызванной Helicobacter pylori, у взрослых при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки" [33] приведена пропись уреазного теста: 2 г мочевины, 10 мл фенолрота (0,5%), 20 мг азида натрия доводят до 100 мл 0,001 М фосфатным буфером, рН 5,5. Чувствительность указанных тестов колеблется от 65 до 95%, специфичность - от 75 до 100% [18].
Предложение ряда исследователей [24, 34, 58] определять уреазную активность в желудочном соке не нашло применения в клинической практике.
Несмотря на простоту и доступность биохимического метода обнаружения НР в биоптатах СОЖ он имеет ряд существенных недостатков. Уреазные тесты дают представление о наличии НР только в одном участке СОЖ, биоптаты не годится для последующего гистологического исследования. Эти ограничения не позволяют в одном и том же участке СОЖ проводить четкую корреляцию между ее структурными изменениями и активностью уреазы. К существенным недостаткам следует отнести возможность получения ложноположительных результатов, так как показано, что у больных с патологией желудочно-кишечного тракта его верхние отделы заселяются грамотрицательными бактериями, из которых многие виды способны продуцировать уреазу, а наиболее часто встречающиеся у человека Proteus vulgaris и Proteus mirabilis способны расщеплять мочевину и те же сроки, что и НР [57].
На уреазной активности НР основаны радионуклидные методы диагностики инфекции (неинвазивные и косвенные) - это уреазные дыхательные тесты с мочевиной, меченной изотопами 13С и 14С [40]. В 1987 г. D. Graham и соавт. [48] опубликовали данные о первом методе с использованием меченной 13С мочевиной для определения Campylobacter pylori в СОЖ. Меченая мочевина дается пациенту в составе пробного завтрака. Уреаза НР разлагает мочевину до углекислого газа, сохраняющего меченый углерод. Углекислый газ с кровотоком доставляется в легкие и выводится с выдыхаемым воздухом. Пациент делает выдох в специальную пробирку-контейнер, и пробу воздуха направляют на анализ. 14С-радиоактивный изотоп, который является источником низкоэнергетических бета-частиц. Его использование имеет ряд ограничений и подчиняется строгому контролю, поэтому данный вариант менее распространен. Для регистрации приращения 14СО2 в выдыхаемом воздухе используют сцинтилляционный счетчик. Изотоп 13С не радиоактивен, может быть количественно определен с помощью газового масс-спектрометра или инфракрасного либо лазерного оборудования. Масс-спектрометры применяются наиболее широко. Поскольку для дыхательного теста не требуется проведения эзофагогастроскопии. этот метод применим у пациентов, которым она противопоказана. Дыхательный тест с изотопом 13C может быть использован для обследования детей, при эпидемиологических исследованиях больших контингентов населения. Этот тест дает представление о всей СОЖ, а не об отдельном ее фрагменте. Его чувствительность достигает 99%, а специфичность - 98% |53|. Тест выполняется в течение 45 мин. и результаты можно получить в течение 24 ч. Высокая стоимость масс-спектрометра ограничивает внедрение дыхательного теста с использованием изотопа 13C. В редких случаях дыхательный тест дает ложноположительных результаты из-за наличия других источников уреазы. Ротовая полость и глотка могут быть колонизированы уреазапродуцирующими бактериями, что и обусловливает ошибочный ответ теста [54]. Ложноотрицательные ответы теста могут быть получены, если пациент принимает антибиотики, соли висмута, а также и редких случаях на фоне приема блокаторов протонной помпы [76]. В связи с этим прием данных лекарств должен быть прекращен по крайней мере за 10 дней до проведения теста.
Агрессия НР и колонизация СОЖ вызывают системный иммунный ответ, в результате чего в крови больного появляются антитела IgA, IgM, IgG к различным бактериальным антигенам, которые могут быть выявлены серологическими методами [73].
Самым распространенным серологическим методом диагностики НР-инфекции является ИФА [40, 59]. Метод неинвазивный и косвенный, в крови больного определяют антитела к НР, относящиеся к IgA, IgM, чаще всего - к IgG. Одними из первых метод ИФА применили В. Rathbone и соавт. [67], которые использовали в качестве антигена препарат из цельных клеток НР, обработанных формалином. В дальнейшем для ИФА и качестве антигена стали применять препараты термической инактивации или ультразвуковой дезинтеграции НР. При использовании этого метода в общем титре антител наиболее ценным является определение уровней IgG- и lgA-антител к НР. Чувствительность метода колеблется от 87 до 98%, специфичность - от 75 до 100% [36, 38]. ИФА - самый подходящий метод для эпидемиологических исследований и скрининга. Его применение в клинической практике определяется индивидуально в конкретной ситуации. Пациенту, предъявляющему гастроэнтерологические жалобы, как правило, необходимо проведение эндоскопии, чтобы оценить состояние гастродуоденальной слизистой оболочки; целесообразно одновременно взять биоптаты для уреазного теста и(или) гистологического исследования, в таком случае ИФА не понадобится [21]. Простое качественное определение антител к НР методом ИФА для диагностики инфекции больших перспектив не имеет. Однако в последние годы были получены диагностические тест-системы на базе ИФА, которые обладают высокой чувствительностью и позволяют количественно определять антитела к НР различных классов [17]. Итальянские исследователи D. Vaira и соавт. [72], используя такие тест-системы, разработали стратегию скрининга НР-инфекции, которая дала обнадеживающие результаты и может быть использована для оценки эффективности эрадикации при исследовании титра антител в динамике.
В настоящее время в распоряжении специалистов клинической лабораторной диагностики имеются диагностические наборы для серологического анализа, которые позволяют оценивать патогенность штаммов НР. Такие штаммы характеризуются наличием CagA-гена, продуцируют цитотоксинассоциированный белок и чаше обнаруживаются у больных язвенной болезнью и раком желудка. Метод ИФА позволяет обнаружить антитела к цитотоксинассоциированному белку в сыворотке крови больных. Диагностическая чувствительность тест-систем для обнаружения антител к CagA-белку НР составляет 90-100%, специфичность - 76-94% [41].
Преимуществом метода ИФА является меньшая травматичность по сравнению со всеми другими методами, где нужно получение биоптата СОЖ. Кроме того, для анализа требуется несколько микролитров сыворотки, в оборудованной лаборатории можно одновременно выполнить десятки исследований и получить результаты в короткие сроки (2,5-3 ч).
Одним из серологических методов диагностики НР-инфекции, обладающим высокой специфичностью, является Western-blot - встречная преципитация в геле антител в сыворотке крови больного с различными белками НР, меченными зондами, подвергнутыми разделению по молекулярной массе с помощью электрофореза и нанесенными на нитроцеллюлозу. С помощью данного метода штаммы НР в настоящее время подразделяют на 4 серотипа в зависимости от выработки микроорганизмами цитотоксина VacA и цитотоксинассоциированного белка CagA: тип I (CagA+, VacA+), тип Iа (CagA+, VacA-), тип Ib (CagA-, VacA+), тип II (CagA-, VacA-) [65]. В своих исследованиях М. Plebani и соавт. [64], В. Д. Пасечников и соавт. [31] показали, что инфицирование CagA-позитивными (серотип Iа) штаммами НР является фактором риска развития выраженного воспалительного ответа в СОЖ. Определение типа штаммов НР у инфицированных имеет важное прогностическое значение. Л. И. Аруин [4], J. Rudi и соавт. [68] приводят данные о том, что пациенты с выявленными у них штаммами CagA+ HP в значительно большей степени подвержены риску развития язвенной болезни и рака желудка, чем инфицированные штаммами CagA.
Недавно разработаны качественные тесты для определения антител к НР, которые можно выполнить "у постели больного". Они основаны на латекс-агглютинации или твердофазном ИФА и выявляют lgA-антитела к НР. Для проведения исследования нужна капля крови, взятой из пальца, результат считывается буквально через несколько минут, никаких дополнительных реактивов не требуется. Диагностическая чувствительности таких тестов составляет 94%. специфичность - 98% [19]. Благодаря уникальной простоте выполнения эти методы незаменимы в небольших больницах или амбулаториях, где потребность в диагностике определяется единичными анализами или в кабинете семейного врача. В 1998 г. появились тест-системы для количественного определения антигена НР в фекалиях больных методом ИФА [25], которые имеют большие перспективы. Диагностическая чувствительность,таких методов в отношении выявления НР составляет 88,9%. специфичность - 94,6% [55].
Современные подходы к диагностике HP-инфекции включают молекулярно-генетические методы исследования, которые представляют собой различные модификации, с обнаружением генетического материала, специфического для рода Helicobacter (16S-pPHK) и вида НР (гены UreA, UreB, Cag, Vac, ice и др.) [30, 40, 66].
ПЦР используется для амплификации ДНК и позволяет в считанные часы размножить in vitro специфический участок ДНК (т. е. любой интересующий нас ген) более чем и 200.000 раз. Чтобы провести реакцию, достаточно иметь ДНК-материал I клетки; количество амплифицированной с помощью ПЦР ДНК столь велико, что эту ДНК можно просто окрашивать. Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК для правильного подбора искусственно синтезированных праймеров [61].
Уникальность метода ПЦР состоит не только в высокой чувствительности и специфичности для выявления НР. но и в том, что материалом для него служат и биоптаты СОЖ, и желудочный сок, и смывы ротовой полости, и зубной налет, и копрофильтраты [35, 69, 71]. Диагностическая чувствительность ПЦР для выявления НР в биоптатах СОЖ составляет 88-95,4%, специфичность - 100% [45, 74|; в копрофильтратах - соответственно 61,4-93,7 и 100% [55, 75].
Несмотря на то что проблема выявления НР неоднократно освещалась в медицинской литературе, разворачиваются новые дискуссии о том, у кого следует проводить выявление бактерий и какими методами это делать. Чтобы помочь практикующим врачам разобраться в большом количестве методов диагностики HP-инфекции и выбрать необходимые, российской группой ученых по изучению НР в 1997 г. были разработаны "Рекомендации по диагностике и лечению инфекции, вызванной Helicobacter pylori, у взрослых при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки" [33]. Принципиальное значение для практики имеет разделение методики выявления НР до лечения (т. е. обнаружение инфекции для обоснованного назначения лечения) и после проведения эрадикационной терапии (для контроля успешности антибактериальной схемы).
Согласно рекомендациям, первичная диагностика необходима у тех больных, которым планируется антихеликобактерная терапия. Чтобы начать лечение, достаточно подтвердить наличие бактерий одним из нижеперечисленных методов.
1. Бактериологический посев биоптата СОЖ на дифференциально-диагностическую среду.
2. Морфологические методы: "золотой стандарт" диагностики HP-инфекции, окраска бактерии в гистологическом препарате СОЖ по Гимзе, толуодиновым синим, Warthin-Starry, Генте; цитологический метод: окраска бактерий в мазках-отпечатках биоптатов СОЖ по Гимзе, Граму.
3. Дыхательный метод: определение в выдыхаемом больным воздухе изотопа 14С или 13С; изотоп выделяется в результате расщепления в желудке больного меченой мочевины под действием уреазы НР.
4. Уреазный метод: определение уреазной активности в биоптате СОЖ путем помещения его в жидкую или гелеобразную среду, содержащую субстрат, буфер и индикатор.
В настоящее время существует большое количество терапевтических схем лечения НР-инфекции, однако оптимальная терапия пока не разработана. В отечественной научной литературе для обозначения лечения в отношении НР широкое распространение получил и "прижился" английский термин "эрадикация". Эрадикация - это полное уничтожение НР как вегетативной, так и кокковидной формы в желудке и двенадцатиперстной кишке больного [33].
Основой лечения HP-инфекции является использование схем комбинированной трехкомпонентной терапии, которые включают: коллоидный субцитрат висмута + тетрациклин + метронидазол (или тинидазол); омепразол (или пантопразол) + кларитромицин + метронидазол; омепразол (или пантопразол) + амоксициллин + кларитромицин. Комбинация 4 лекарственных препаратов - квадротерапия (омепразол + коллоидный субцитрат висмута + тетрациклин + метронидазол) рассматривается как терапия резерва. Ее эффективность в отношении НР оценивается как максимальная.
Эрадикационная терапия не всегда оказывается успешной. Для ведущих научных центров эрадикация НР выше 80% является отличным показателем эффективности терапии [10].
Одной из главных причин низкой эффективности схем антихеликобактерной терапии является резистентность штаммов НР к антибактериальным препаратам, которые входят в эти схемы. Согласно данным Л. В. Кудрявцевой и соавт. [20], резистентность штаммов НР у взрослого городского населения России увеличилась за период с 1996 по 1998 г.: к метронидазолу с 36,1 до 56,9%; к кларитромицину с 0 до 14,4%; растет также число штаммов с полирезистентностью (6%). В Москве уровень резистентности штаммов НР к метронидазолу составляет 56,6%, к кларитромицину - 16,6%.
Маастрихтские рекомендации указывают на то, что исследование чувствительности НР к антибактериальным препаратам при первом назначении не обязательно [56]. Назначение схемы лечения в таком случае должно основываться на эпидемиологических данных и показателе распространенности резистентности в конкретной стране, еще лучше - в регионе. В настоящее время признано, что при распространенности резистентности к кларитромицину менее 15%, а к метронидазолу менее 30% все еще возможно применять эти препараты [29]. В связи с тем что данные о резистентности к антибактериальным препаратам значительно превышают приведенные показатели, все больше исследователей считают необходимым определение чувствительности перед проведением лечения [46]. Это значительно повышает значимость бактериологического метода.
Диагностика эрадикации, т. е. контроль успешности проведения антибактериального лечения, является одной из важнейших проблем и требует особых подходов. В "Рекомендациях по диагностике и лечению инфекции, вызванной Helicobacter pylon, у взрослых при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки" [33] определены следующие требования для диагностики эрадикации.
1. Диагностика эрадикации должна осуществляться не ранее чем через 4-6 нед после окончания курса антихеликобактерной терапии либо окончания лечения сопутствующих заболеваний любыми антибиотиками или антисекреторными средствами.
2. Диагностика эрадикации осуществляется как минимум двумя из указанных диагностических методов, причем при использовании методов непосредственного обнаружения бактерий в биоптате СОЖ (бактериологический, морфологический, уреазный) необходимо исследование 2 биоптатов из тела желудка и 1 биоптата из антрального отдела.
3. Цитологический метод для установления эрадикации неприменим.
В настоящее время дыхательный тест с мочевиной, меченной изотопом 13С, считается наилучшим методом оценки эффективности эрадикационной терапии [32]. P. Johnson и соавт. [50] на большом клиническом материале изучили эффективность дыхательного теста методом масс-спектрометрии в оценке эффективности эрадикации. Было показано, что уже через 4 нед после лечения отмечается снижение содержания 13СО2 в выдыхаемом воздухе при эффективном лечении. В. Т. Ивашкин и соавт. [16] в своих исследованиях показали, что проведение дыхательного теста с использованием лазерного метода до терапии и через 4 и 12 нед после курса терапии позволяет оценивать эффективность применения различных схем лечения. У 50% пациентов уже через 4 нед после лечения наблюдали значительное снижение концентрации 13С (с 25-100 до 5 промилле) в выдыхаемом воздухе, что свидетельствовало о подавлении колонии НР. Через 12 нед после курса терапии у части пациентов наблюдается восстановление колоний НР, соответственно число больных с низкими значениями концентрации 13C, свидетельствующими об отсутствии инфицированности, снижалось до 35%. Большинство исследователей сходятся во мнении, что окончательное суждение об эффективности эрадикации НР с помощью дыхательного теста можно сделать не ранее чем через 4 нед после курса лечения.
Определение в сыворотке крови специфических IgA-, IgM-и IgG-антител к НР активно используется для скрининга и первичной диагностики инфекции. Однако существует ряд ограничений, затрудняющих применение серологических методов для контроля за лечением инфекции. Одно из наиболее важных ограничений связано с тем, что концентрация специфических антител к НР снижается в крови пациентов и при успешной терапии, и при персистировании инфекции. При этом, по данным разных авторов, снижение титра происходит в сроки от 3 до 6 мес, а иногда до 24 мес после лечения [46]. В связи с этим качественная серологическая диагностика для контроля эффективности терапии HP-инфекции не может быть рекомендована. Наличие антител к НР в крови однозначно не свидетельствует о присутствии активной инфекции в СОЖ и может иметь следовой характер. Только в том случае, если использована количественная методика ИФА и есть возможность сравнить уровень антител после лечения с исходным их уровнем, можно сделать определенные выводы. Информативным считается более чем 50% падение титра антител в анализе, взятом через 6 мес после окончания курса антихеликобактерной терапии [40]. Полугодовое ожидание для определения результата лечения, трудность организации взятия и хранения двух проб крови, меньшая доступность количественных методик ИФА по сравнению с качественными не позволяли рекомендовать этот метод для контроля эрадикации инфекции [21].
Диагностические тест-системы нового поколения на базе ИФА обладают высокой чувствительностью и позволяют количественно определять антитела различных классов НР, что активно используется для оценки эффективности лечения. A. Cutler и V. Prasad [44], G. Perez-Perez и соавт. [63], используя такие тест-системы, разработали стратегию применения серологических тестов для оценки эрадикации, которая дала обнадеживающие результаты. В сравнении с инвазивными методами (гистологический, уреазный) было показано, что если через 30-40 дней после лечения титр IgG-антитсл уменьшился на 20% и более, можно считать, что в результате лечения наступила эрадикация НР; если значение титра повышается, не изменяется или его уменьшение составляет менее 20%, это необходимо расценивать как отсутствие эрадикации. Аналогичные результаты были получены отечественными исследователями [13].
Метод ИФА с количественным определением антигена НР в фекалиях находит все большее применение для оценки эффективности эрадикации. Мультицентровое исследование в странах Европейского союза, проведенное более чем у 400 больных, подтвердило его высокую эффективность в оценке эрадикации в сравнении с инвазивными методиками и дыхательным тестом [I7]. Стоимость I анализа пока остается на уровне стоимости дыхательного теста.
В арсенале тестов для оценки эффективности лечения НР-инфекции имеется также ПЦР, которая остается наиболее информативной [11]. ПЦР для выявления уреазного гена НР в биологическом материале применяется довольно давно в качестве контрольного метода в научных исследованиях, однако оптимизация методики привела к ее существенному удешевлению и возможности использования в клинической практике. Ряд авторов считают ПЦР наиболее чувствительным методом оценки эрадикации в ранние сроки после лечения [55, 77].
Сроки в 4-6 нед для оценки эффективности эрадикации ряд авторов обосновывают тем, что применение антибактериальных препаратов резко снижает количество НР в СОЖ, поэтому сразу после окончания лечения даже в случае его неудачи НР не обнаруживается. Ложноотрицательные результаты обусловлены тем, что НР может отсутствовать в случайно взятых единичных биоптатах СОЖ или находиться там в таких незначительных количествах, которые не обнаруживаются используемыми диагностическими методами (гистологический, уреазный, бактериологический). В реальной практике это приводит к тому, что пациенты в случае неэффективного лечения выписываются из стационара и не обращаются к врачу до следующего обострения заболевания. В связи с этим оценить эффективность эрадикации в сроки позже 4-6 нед практически очень сложно.
Таким образом, необходимо продолжать поиск и внедрение в клиническую практику новых методов диагностики НР-инфекции и оценки эффективности ее лечения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аруин Л. И., Смотрова И. А., Ильченко А. А. // Арх. пат. - 1988. - N 2. - С. 13-18.
2. Аруин Л. И., Григорьев П. Я., Исаков В. А., Яковенко Э. П. Хронический гастрит. - Амстердам, 1993.
3. Аруин Л. И., Исаков В. А. // Арх. пат. - 1995. - Т. 57, N 3. - С. 75-76.
4. Аруин Л. И. // Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori: 2-й Международный симпозиум "Современные проблемы физиологии и патологии пищеварения". - М., 1999. - С. 33-37.
5. Баженов Л. Г., Ходжаева Н. У., Садыков Р. А., Саидханов Б. А, II Клин. лаб. диагн. - 1993. - N 5. - С. 19-22.
6. Баженов Л. Г., Перепелова И. Н. // Журн. микробиол. - 1997.-N 3.- С. 100-101.
7. Говорунов В. М., Гущин А. Е., Исаков В. А. и др. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2000. - Т. 10, N 2.-С. 12-15.
8. Гребенев А. Л., Лапина Т. Л., Склянская С. А. и др. // Клин. лаб. диагн. - 1995. - N 6. - С. 104-105.
9. Григорьев П. Я., Яковенко Э. П. // Рос. мед. журн. - 1996. - N 6. - С. 56-59.
10. Григорьев П. Я., Яковенко Э. П. // Рос. гастроэнтерол. журн. - 1997. - N 2. - С. 31-35.
11. Григорьев П. Я., Жуховицкий В. Г., Яковенко Э. П., Яковенко А. В. II Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1998. - Т. 8, N8 4. - С. 6-9.
12. Диагностика и лечение кампилобактериальных поражений желудка и двенадцатиперстной кишки: Метод. рекомендации / Логинов А. С., Аруин Л. И., Ильченко А. А., Жуховицкий В. Г. - М., 1988.
13. Дурова О. М., Исаков В. А., Иваненко Т. В. и др. // Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori: 2-й Международный симпозиум "Современные проблемы физиологии и патологии пищеварения". - М., 1999. - С. 60-63.
14. Ивашкин В. Т., Лапина Т. Л. // Диагностика и лечение. - 1996. -N 11. - С. 3-10.
15. Ивашкин В. Т. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1997. - Т. 7. N 1. - С. 21-23.
16. Ивашкин В. Т., Никитина Е. И., Степанов Е. В. и др. // Там же. - 1999. - Т. 9, N 2. - С.53-60.
17. Исаков В. А. // Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori: 2-й Международный симпозиум "Современные проблемы физиологии и патологии пищеварения". - М., 1999. - С. 12-15.
18. Корниенко Е. А., Милейко В. Е. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол.,- колопроктол. - 1988. - Т. 8, N 6. - С. 34-38.
19. Кудрявцева Л. В.. Минаев В. И. // Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori: 2-й Международный симпозиум "Современные проблемы физиологии и патологии пищеварения". - М., 1998. - С. 4.
20. Кудрявцева Л. В., Довгаль С. Г., Щербаков П. Л., Иваников И. О. II Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2000. - Т. 10, N 2, Прил. N 10. - С. 41.
21. Лапина Т. Л. // Там же. - 1999. - Т. 9, N 2. - С. 41-45.
22. Логинов А. С., Аруин Л. И., Ильченко А. А. Язвенная болезнь и Helicobacter pylori. Новые аспекты патогенетической терапии. - М., 1993.
23. Маркова Г. А., Бошнаков Р. X., Петров П. К. и др. // Мол. генетика. - 1994. - N 1. - С. 10-15.
24. Москвич Ц. Г., Соколовский В. В., Пак С. Ф. // Клин. мед. - 1989. - Т. 67, N 1. - С. 80-81.
25. Мегро Ф. // Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori: 2-й Международный симпозиум "Современные проблемы физиологии и патологии пищеварения". - М., 1998. - С. 1.
26. Минушкин О. Н., Васильева Н. Ю., Минаев В. И. и др. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1997. - Т. 7, N 4. -С. 6-10.
27. Минушкин О. Н., Васильева Н. Ю. // Кремлев. медицина. - 1998. - N 2. - С. 9-И.
28. Митрохина Т. В., Фитилев С. Б., Графская Н.Д., Павлова М. В. // Хирургия. - 1996. - N 2. - С. 39-42.
29. Морозов И. А. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1999. - Т. 9, N 2. - С. 46-48.
30. Пасечников В. Д., Чуков С. 3., Правдина И. А. и др. // Там же. - 1998. - Т. 8, N 4. - С. 28-31.
31. Пасечников В. Д., Чуков С. 3., Правдина И. А. Там. же. - 2000. - Т. 10, N 2. - С. 63-65.
32. Пахарес-Гарсиа X. М. // Там же. - 1999. - Т. 9, N 2. - С. 48-52.
33. Рекомендации по диагностике и лечению инфекции Helicobacter pylori у взрослых при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки // Там. же. - 1998. - Т. 8, N 1. - С. 105-107.
34. Рожавин М. А., Сорлогуб В. В., Микитюк И. Б. // Журн. микробиол. - 1989. - N 1. - С. 111 - 112.
35. Семин С. Г., Щербаков П. Л., Шипулин Г. Ф. и др. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2000. - Т. 10, N 2. - С. 82-83.
36. Серебрянская М. В. // Клин. мед. - 1994. - Т. 72, N 6. - С. 40-42.
37. Склянская О. А., Лапина Т. Л., Мягкова Л. П. и др. // Развитие идей академика В. X. Василенко в современной гастроэнтерологии: К 96-летию со дня рождения. - М., 1993. - Т. 2. - С. 85-87.
38. Чайка Н. А., Хазенсон Л. Б., Бутилер Ж. П. Кампилобактериоз. - М., 1988.
39. Atherton J. С., Peek R. М., Тhат К. Т. et al. // Am. J. Gastroenterol. - 1994. - Vol. 89. - P. 1322.
40. Atherton J. C. // Aliment. Pharmacol. Ther. - 1997. - Vol. 11. - Suppl. I. - P. 11-20.
41. Basso D., Stefani A., Brigato L. et al. // J. Clin. Lab. Anal. - 1999. - Vol. 13, N 4. - P. 194-198.
42. Cave D. Y. // Gastrocnterology. - 1997. - Vol. 113. - Sup-pi. I. - P. 48-51.
43. Cohen H., Laine L. // Aliment. Pharmacol. Ther. - 1997. - Vol. 11.- Suppl. I. - P. 3-9.
44. Cutler A., Prasad V. // Am. J. Gastroenterol. - 1996. - Vol. 91. - P. 85-88.
45. Germani Y., Dauga C., Duvat P. et al. // Res. Microbiol. - 1997. - Vol. 148, N 4. - P. 315-326.
46. Glupczynski Y. // Acta Gastroenterol. Belg. - 1998. - Vol.61.- P. 321-326.
47. Go M. F., Cissell L, Graham D. Y. // Scand. J. Gastroenterol. - 1998.-Vol. 33. - P. 132-137.
48. Graham D. Y., Klein P. D., Evans D. J. et al. // Lancet. -1987. - Vol. 1, N 8543. - P. 1174-1177.
49. Graham D. Y. // Gastroenterology. - 1997. - Vol. 113. - Suppl. - P. 48-51.
51. Lee A., Megraud F. // Helicobacter Pylori: Techniques for Clinical Diagnosis and Basic research / Print. - London, 1996.
52. Mellgard В., Helander H. // Scand. J. Gastroentcrol. - 1997. - Vol. 32. - P. 439-444.
53. Logan R. P. H. // Helicobacter pylori and Gastroduodenal Disease / Eds B. J. Rathbone, V. R. Heartley. - 2-nd Ed. -Oxford, 1992. - P. 88-107.
54. Logan R. P. H. // Helicobacter Pylori Techniques for Clinical Diagnosis and Basic Research. - London, 1996. - P. 74-83.
55. Makristathis A., Pasching E., Schetze K. et al. // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36. N 9. - P. 2772-2774.
56. Malfertheiner P., Megraund F., O"Morain C. et al. // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. - 1997. - Vol. 9, Pt. I. - P. 2.
57. Marshall B. J., Warren J. R. // Lancet. - 1984. - Vol. 1, N 8390. - P. 1311-1311.
58. Marshall B. J. // Hosp. Pract. - 1987. - Vol. 22, N 8. -P. 87-96.
59. Megraud F. // Gastroenterology. - 1997. - Vol. 113. - Sup-pi. - P. 593-598.
60. Montogomeri E. A., Martin D. F. Peura D. A. // Am. J. Clin. Pathol. - 1988. - Vol. 90, N 5. - P. 606-609.
61. Oksanen K., Kainulainen H., Ruuska T. et al. // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. - 1999. - Vol. 28, N 3. - P. 252-256.
62. Pajares Garcha J. M. // Ital. J. Gastroenterol. Hepatol. - 1988. - Vol. 30. - Suppl. 3. - P. 320-323.
63. Perez-Perez G. /., Dworkin B. M., Chodos J. E. et al. // Ann. Intern, med. - 1988. - Vol. 190, N 1. - P. 11-17.
64. Plebani M., Guariso G., Fogar P. et al. // Helicobacter. - 1999. - Vol. 4, N 4. - P. 226-232.
65. Purk S. M., Hong S. /., Jung H. Y. et al. // X EHPSG International Workshop: Abstracts-On-Disk, 1997.
66. Pappuoli R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1993. - Vol. 90. - P. 5791-5795.
67. Rathbone B. J.. Wyatt J. I., Heatley R. V. // Gut. - 1956. - Vol. 27, N 6. - P. 635-641.
68. Rudi J., Rudy A., Maiwald M. et al. // Am. J. Gastroenterol. - 1999. - Vol. 94, N 6. - P. 1525-1531.
69. Schwurz E., Plum G., Mauff G. et al. // Z. Bakteriol. - 1997. - Bd. 285, N 3, - S. 368-378.
70. Shimoyama Т.. Fukuda S., Tanaka M. et al. // J. Clin. Pathol. - 1998. - Vol. 51, N 3. - P. 225-228.
71. Song Q., Halter В., Schmid R. M. et al. // Dig. Dis. Sci. - 1999. - Vol. 44, N 3. - P. 479-484.
72. Vaira D., Slanghellini V., Menegalti M. et al. // Endoscopy. - 1997. - Vol. 29, N 7. - P. 595-601.
73. Vaira D., Holton J., Menegatti M. et al. //Gut. - 1999. - Vol. 45. - Suppl. 1. - P. 123-127.
74. Van der Wouden E. J., Thijs J. C., van Zwet A. A. et al. // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. - 1999. - Vol. 11, N 11. - P. 1255-1258.
75. Watanabe Т., Tomita S., Kudo M. et al. // Scand. J. Gastroenterol. - 1998. - Vol. 33. N 11. - P. 1140-1143.
76. Weil J., Bell G. D., Powell K. et al. // Aliment. Pharmacol. Ther. - 1991. - Vol. 5. - P. 309-313.
77. Yamamura F., Yoshikawa N., Akita Y. et al. //J. Gastroenterol.- 1999. - Vol. 34, N 4. - P. 461-466.
© Copyright AMA Ltd. 2004.