Диагностика инфекции H.pylori у детей
Щербаков П.Л. Научный Центр Здоровья Детей РАМН, Москва
На протяжении 16 летней истории изучения проблемы H.pylori инфекции одной из главной проблем является ее своевременное и достоверное распознавание. Все способы диагностики, используемые в настоящее время, условно можно разделить на прямые и непрямые, на инвазивные и неинвазивные.
Прямые методы основаны на обнаружении микроорганизмов с помощью гистологических, микробиологических или молекулярных способов. Непрямые методы регистрируют продукты жизнедеятельности микробов или различные активные соединения, образуемые макроорганизмом в ответ на инвазию H.pylori (антигены H.pylori, специфические АТ и пр.). Все используемые методики выявления хеликобактериоза имеют различную специфичность и чувствительность.
Большинство прямых методов в настоящее время основаны на инвазивных способах забора материала. Прямая диагностика инфекции H.pylori в настоящее время является достаточно трудоемким и отсроченным по времени процессом. Она включает себя проведение эзофагогастродуоденоскопии с взятием биоптатов слизистой оболочки для последующего исследования.
Эндоскопическое исследование органов пищеварения нельзя рассматривать только в качестве посреднического исследования для получения биоптатов слизистой. Эзофагогастродуоденоскопия имеет значительную самостоятельную диагностическую ценность. Во время ее проведения определяются достаточно специфические эндоскопические признаки, характерные для хеликобактерной инфекции. В частности к ним относятся: наличие язв в луковице двенадцатиперстной кишки, множественные разнокалиберные выбухания на стенках слизистой оболочки антрального отдела желудка, гиперемия слизистой оболочки, наличие мутной слизи в просвете желудка, отек и утолщение складок антрального отдела и тела желудка [12]
Чувствительность и специфичность отдельных признаков различна. Наиболее достоверными являются язвы луковицы двенадцатиперстной кишки (чувствительность и специфичность 100%) и наличие разнокалиберных выбуханий на стенках антрального отдела желудка (чувствительность 93%, специфичность 96%). Аналогичные данные позже были получены и другими исследователями, которые подчеркивают ведущее диагностическое значение выбуханий в антральном отделе, бывающими столь выраженными, что получили название “нодулярного гастрита”. При этом слизистая оболочка желудка приобретает характерную картину “булыжной мостовой” [14, 15].
Биоптаты слизистой оболочки желудка для проведения дальнейших исследований забираются из антрального отдела и тела желудка под контролем зрения. Обычно фрагменты слизистой оболочки берутся из антрального отдела по вершинам воображаемого равностороннего треугольника с привратником в центре, на расстоянии 2-4 см от него; из тела желудка по большой и малой кривизне и из свода желудка.
Морфологическое исследование биоптата слизистой оболочки с оценкой степени обсемененности позволяют достаточно достоверно определять H.pylori и являются своеобразным “золотым стандартом” при сравнении информативности различных способов диагностики хеликобактериоза [10]. Для выявления H.pylori на поверхности слизистой оболочки используют различные методики окраски срезов биоптатов. Наиболее часто используются окраски акридиновым оранжевым (чувствительность составляет 85%), методом Гимзы (79%), серебрением по Вартин-Старри (67%) [16]. Наиболее чувствительным, для обнаружения H.pylori, является иммуноцитохимический метод с моноклональными антителами и комплексом авидин биотин пероксидазы. Моноклональные АТ избирательно окрашивают только H.pylori, что значительно облегчает диагностику [11]. При изучении биоптатов выделяют три степени обсемененности СО H.pylori: 1.слабая - до 20 микробных тел в поле зрения (х630), 2.средняя - до 50 микробных тел в поле зрения, 3.- сильная - более 50 микробных тел в поле зрения, обозначаемые условными знаками (+-; ++; +++) [1]
Наибольшую информацию о H.pylori возможно получить только при выделении его из прижизненных биопсийных образцов. При использовании бактериологического метода возможно не только получение чистой культуры возбудителя, но и ее идентификация с дальнейшим изучением биологических свойств. Бактериологическое исследование незаменимо и при контроле лечения, когда количество бактерий в организме может быть настолько малым, что не определяется другими методами лабораторной диагностики [7].
В эпидемиологической практике выделение чистой культуры необходимо для внутривидового типирования штаммов H.pylori, что может быть использовано при мониторинге для дифференциации между реинфекцией новым штаммом и рецидивированием, обусловленным тем же штаммом. В научной практике бактериологический метод важен, так как позволяет изучать факторы патогенности H.pylori и изготовлять препараты для серологической диагностики. К недостаткам этого метода относятся, прежде всего, необходимость специального оборудования лаборатории и реактивов позволяющих выделять и идентифицировать H.pylori, а также обученных кадров специалистов. Все это сопряжено с большими материальными затратами [7].
Результаты исследования отсрочены от момента взятия биопсии минимум на 3-5 дней, рост чистой культуры на питательной среде обнаруживается, как правило, только при обострении заболевания и наличии выраженных визуальных признаков воспаления. Поскольку H.pylori очень чувствителен к условиям внешней среды и быстро погибает, необходимо строго соблюдать правила транспортировки биопсийного материала. Лучшей, на сегодняшний день средой, для транспортировки биопсийных образцов признана Pylori® (Bio-Merioux, Франция), которая способна стабильно поддерживать жизнеспособность чистой культуры H.pylori в течении 4-5 суток. Посев биопсийного материала производят не менее чем на 2 питательные среды (неселективную и селективную). Для культивирования и выделения H.pylori предложено достаточно большое количество неселективных питательных сред с 5-10% содержанием крови лошади или барана и агаром. Поскольку природная экологическая ниша H.pylori не является стерильной, то для выделения H.pylori из биоптатов лучше всего использовать селективные питательные среды, содержащие антибактериальные препараты, в состав которых включены ингибиторы роста кокковой, кишечной и грибковой микрофлоры. При культивировании H.pylori возникают определенные трудности, так как эти микроорганизмы микроаэрофилы и растут в особых условиях. Необходимую для культивирования атмосферу создают заполнением анаэростатов газовой смесью или с помощью коммерческих газогенерирующих пакетов. Оптимальный рост колоний наблюдают при рН среды от 6,7 до 8,0 при 32-39° С. Как правило на неселективной питательной среде H.pylori на 3-5 сутки формирует мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, росинчатые колонии диаметром 1-3 мм. На селективной питательной среде колонии H.pylori приобретают характерное золотисто-желтое окрашивание, за счет присутствующего в этой среде трифенилтетразолиумхлорида [13].
При получении роста колоний, по морфологии сходных с H.pylori, проводится их идентификация, которая включает в себя окраску мазка по и 3 биохимических теста - уреазный, каталазный и пероксидазный (все 3 теста положительные) [7].
Наиболее достоверным в диагностике H.pylori инфекции является использование полимеразной цепной реакции для идентификации этого микроорганизма. В настоящее время полностью расшифрована генная структура H.pylori. Проведение ПЦР позволяет обнаруживать в биоптатах СО генетический материал, специфичный для рода Нelicobacter (16S-рРНК) и вида Н.рylori (гены ureA, ureB, cagA, vacA и другие).
ПЦР, изобретенная Kary Mullis и улучшенная впоследствии другими исследователями, фундаментально изменила молекулярную биологию, открыв новые горизонты в медицинских и биологических науках. По своей мощности это новое биологическое исследование может быть сравнимо с открытием методов молекулярного клонирования приблизительно 25 лет назад. В основу ПЦР положена удивительно простая концепция, впервые предложенная 30 лет назад и очень напоминающая способ, посредством которого клетки дублируют свою ДНК in vivo. Цикл реакции составлен из трех этапов: денатурации (для полного разделения двух цепочек в ДНК молекулах); ренатурации (формирование комплекса между праймерами и целевой последовательностью); этап расширения (соединение праймера с цепочкой ДНК, удлиняясь с помощью полимераз). После денатурации две цепочки ДНК отделяются, и каждый праймер высвобождается для поиска комплементарной последовательности. В процессе охлаждения отжиг праймера к исследуемой области формирует устойчивый комплекс, который далее стабилизируется собственно полимеразой. В конце цикла в пробирке имеется вдвое большее количество ДНК по сравнению с первоначальным количеством. Затем цикл повторяется, и количество ДНК удваивается далее с каждым циклом. Эта амплификация совершается в геометрической прогрессии совершенно аналогично ядерной цепной реакции с двукратным, четырехкратным, восьмикратным, 16-кратным, 32-кратным, и т. д., увеличением при последующих циклах. После n циклов степень амплификации - соответственно 2n. Таким образом, после 10 циклов достигается 1024-кратная амплификация, а после 20 - 106-кратная [8].
В последнее время появилась возможность проводить ПЦР-диагностику по определенным участкам гена (в частности ureC) на основе высокоспецифичных для данного микроорганизма праймерами. Этот метод диагностики позволяет диагностироваить наличие H.pylori как в вегетативной, так и в кокковой форме. Более того, в последнее время появились отечественные разработки проведения ПЦР из образцов кала. Это позволит сделать метод ДНК-диагностики H.pylori неинвазивным, что существенно расширит спектр его применения в клинике [3].
Гистологические и микробиологические исследования, обладают высокой информативностью и достоверностью, но являются трудоемкими и достаточно длительными.
В связи с этим приобретает особую актуальность разработка новых диагностических экспресс-тестов и стандартизация признаков хеликобактериоза, выявляемых при различных исследованиях органов пищеварения.
Нами проводилась оценка эффективности нескольких видов экспресс-тестов для диагностики ПХ: промышленные наборы “CLO-test” фирмы “Delta” (Австралия), “Де-нол-тест” фирмы “Yamanouchi”(Япония) и лабораторные тесты “Campy-test”, разработанный под руководством проф. П.Я.Григорьева (1989), “Хеликотест”, предложенный к.б.н. В.Г.Жуховицким (1992) и быстрый уреазный тест, разработанный в ЦКБ МЦ УД Президента РФ.
Экспресс-диагностика пилорического хеликобактериоза основана на свойстве H.pylori - в огромном количестве (по сравнению с другими микробами) выделять уреазу, которая разлагает мочевину, входящую в состав диагностического теста, на углекислый газ и аммиак. В результате этого рН среды смещается в щелочную сторону и регистрируется по изменению окраски диагностикума. Время экспозиции после помещения биоптата в среду различно. Так, при выполнении CLO - теста и Campy-теста результат получали через 24 часа, проведение Хеликотеста позволяло сделать заключение о наличии Н.pylori в течение 2 часов. Самыми “быстрыми” тестами явились Де-нол тест и быстрый урезный тест, при которых результат оценивался в течение 5-20 мин.
Все экспресс-методы обладали разной чувствительностью и специфичностью (Таблица 1)
ТАБЛИЦА 1.
Сравнительная характеристика экспресс-тестов для диагностики H.pylori.
Скорость изменения окраски экспресс-диагностикумов зависела от степени обсемененности слизистой оболочки микроорганизмами, которая подтверждалась последующим гистологическим исследованием. Наиболее выраженной эта закономерность прослеживалась при проведении Де-нол теста® и быстрого уреазного теста ЦКБ. При высокой степени обсемененности слизистой оболочки пилорическими хеликобактериями время изменения окраски этих диагностикумов не превышало 5 минут, если изменение цвета происходило в течение 5-15 минут, то степень обсемененности была преимущественно средней, а при низкой степени обсемененности реакция наступала через 15-30 минут. Если время реагирования теста превышало 30 минут, результат считался сомнительным.
Таким образом, все тесты обладали достаточно высоким уровнем чувствительности и специфичности. Для экспресс-диагностики на наличие пилорических хеликобактерий можно использовать любой из них, однако, предпочтение, по нашему мнению, следует отдавать Де-нол тесту или оригинальному, быстрому уреазному тесту ЦКБ, позволяющему не только быстро провести качественную реакцию, но и косвенно оценить степень обсемененности слизистой оболочки этими бактериями.
Проводимые нами уреазные экспресс-тесты достаточно информативны, но тем не менее они являются качественными реакциями, регистрирующими лишь продукты жизнедеятельности H.pylori. Потому в настоящее время продолжаются поиски экспресс-методов диагностики, позволяющих не только качественно, но и количественно оценить инфицированность СО пилорическими хеликобактериями.
В последнее время все большее значение в качестве диагностического метода оценки состояния полых органов ЖКТ получает их ультразвуковое cканирование. Этот способ, являясь неинвазивным, наряду с достаточно высокой информативностью позволяет длительно следить за состоянием внутренних органов в динамике.
Нами была предпринята попытка выявить диагностические признаки пилорического хеликобактериоза при ультразвуковом исследовании ВОПТ (натощак и после приема воды), проводимом параллельно с ЭГДС со взятием биопсии СО желудка.
Такие ультразвуковые признаки как большое количество жидкости в просвете желудка натощак (более 30 мл), повышенная толщина стенок (более 4 мм), смазанность внутреннего контура СО и нечеткая слоистость стенок желудка коррелируют с наличием в желудке H. pylori (р < 0,05) и служат ориентировочными маркерами хеликобактерной инфекции при ультразвуковом исследовании. Аналогичные данные были получены и другими исследователями при изучении пилорического хеликобактериоза [2, 5, 9].
Таким образом, метод ультразвукового сканирования полых органов ВОПТ может использоваться для дополнительного динамического наблюдения за состоянием СО при диагностике детей, инфицированных H. pylori.
В последнее время, наряду с разработкой более чувствительных и специфичных методов выявления H.pylori и продуктов их жизнедеятельности в биоптатае СО, все большее распространенеие получают неинвазивные методы диагностики.
Европейской и Российской группой по изучению H.pylori в 1998 году были приняты диагностические алгоритмы, определяющие проведение первичной диагностки инфекции H.pylori неинвазивными методами.
Дыхательный тест с меченными атомами 13С стал стандартным исследованием во многих странах Европы.
Для быстрой диагностики H.pylori с достаточно высокой степень специфичности (98%) в последнее время широко используются иммунологические методики, основанные на определении АТ к H.pylori в каппилярной крови (в России зарегестрированы тесты FastRead H.pylori®, (CQI-biomed) и Pyloriset® Dry (Orion Diagnostica). Преимуществом таких методик является простота их выполнения и быстрота получаемого результата. К недостаткам следует отнести невозможность использовать их для контроля за эрадикацией.
Другим неинвазивным методом диагностики H.pylori является ИФА. Эти методики становятся не только качественным диагностикумом, но с помощью них появляется возможным проводить количественное определение степени инвазии H.pylori, а также степень эрадикации [4]. ИФА позволяет определять антиген H.pylori с высокой степенью чувствительности в фекалиях больного. Этот метод становится все более распространенным в странах Европы и Америки несмотря на его высокую стоимость, аналогичную с дыхательным тестом [6].
21 апреля 1997 г., в Москве, на научной конференции посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР В.Х. Василенко “Язвенная болезнь и рак желудка. Новые взгляды в эру Helicobacter pylori”, были приняты рекомендации по диагностике и лечению инфекции H.pylori, разработанные Российской группой по изучению H.pylori (RHPSG) 9-10 мая 1998 года Европейское Гастроэнтерологическое Общество (ESPCG) разработало и утвердило рекомендации по диагностике и лечению инфекции H.pylori. Однако принятые “Рекомендации” относятся, к сожалению, только к взрослым больным.
Исключительное значение инфекции H.pylori в развитии заболеваний ЖКТ срeди детей разного возраста свидетельствует о необходимости разработки “Рекомендаций” по диагностике и лечению заболеваний, ассоциированных с H.pylori.
В 1997 году вышел в свет “Проект согласованных рекомендаций по диагностике и лечению Helicobacter pylori - ассоциированного гастрита и язвенной болезни у детей” (Российский вестник перинатологии и педиатрии, 1997-№6,-С.56-58). За прошедшее время появились новые методики и схемы, позволяющие своевременно и эффективно диагностировать и проводить лечение H.pylori-инфекции. В связи с этим назрела необходимость их пересмотра.
Во время проведения IV Российской Гастроэнтерологической Недели в Москве, на заседании Детской секции были обсуждены и приняты
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ ИНФЕКЦИИ HELICOBACTER PYLORI У ДЕТЕЙ.
Диагностика инфекции H.pylori
Первичная диагностика
Диагностика инфекции H.pylori осуществляется методами, позволяющими выявить микроорганизм или признаки его жизнедеятельности в организме больного Для первичной диагностики следует как можно шире использовать неинвазивные методы:
1. Обнаружение специфических антихеликобактерных АТ классов А и G в крови больного (иммуноферментный анализ, экспресс-тесты на основе реакции преципитации или иммуноцитохимиии с использованием каппилярной крови больных
2. Дыхательные тесты с регистрацией продуктов жизнедеятельности H.pylori (углекислый газ, аммиак)
3. ПЦР в анализах кала, слюны, зубном налете.
Инвазивные методы диагностики все меньше используются для первичной диагностики, в то же время сохраняют свою актуальность для контроля за эрадикацией. Под эрадикацией понимается полное уничтожение микроорганизма, определяемое через 6 недель после проведенного лечения. Диагностика эрадикации должна осуществляться как минимум двумя способами. В настоящее время проводится разработка тестов и методов неинвазивного контроля за эрадикацией. При диагностике эрадикации инвазивным методами необходимо исследовать фрагмент слизистой оболочки антрального отдела желудка и фрагмент фундального отдела желудка.
1. Эндоскопическое исследование с визуальной оценкой состояния слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки
2. Морфологический - определение микроорганизмов в препарате слизистой оболочки при специальных окрасках ( по Гимзе, толлуидиновым синим, Генте, Вартину-Старри)
3. Бактериологический - определение штамма микроорганизма, выявление его чувствительности к применяемым препаратам
4. ПЦР слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки.
Список литературы.
1. Аруин Л.И.; Смотрова И.А.; Ильченко А.А. / Campylobacter pyloridis при язвенной болезни.- // Арх.пат.. - 1988.- №2.- с.13-18.
2. Ганган В.С. Эхографические изменения желудка, двенадцатиперстной кишки и пищевода при хронической гастродуоденальной патологии у детей : Автореф. дис... канд. мед. наук.- М.1994.- 24с.
3. Гущин А.Е.; Туркин П.С.; Говорун В.М.// “Хеликопол-2” - диагностическая система для определения H.pylori на основе ПЦР/ в кн. Диагностика и лечение заболеваний ассоциированных с H.pylori , М. 1999. - с.19.
4. Дурова О.М., Исаков В.А., Иваненко Т.В. и др. // Непрямой иммуноферментный анализ для определения эрадикации H.pylori: предварительные результаты сравнительного исследования./ в кн. Диагностика и лечение заболеваний ассоциированных с H.pylori , М. 1999. - с60-61.
5. Заблодский А.Н. Эндоскопически-эхографические параллели в диагностике заболеваний гастродуоденальной зоны у детей : Автореф. дис... канд. мед. наук.- Минск.- 1996.- 16 с.
6. Исаков В.А. // Новые технологии в диагностике H.pylori / в кн. Диагностика и лечение заболеваний ассоциированных с H.pylori , М. 1999. - с.12-14.
7. Кудрявцева Л.В Изучение диагностической ценности различных методов диагностики хеликобактериоза. Дисс. Канд.мед. наук.// М.1999. - 154.С.
8. Пасечников В.Д./ Полимеразная цепная реакция в диагностике H.pylori -ассоциированных заболеваний.// в кн. Диагностика и лечение заболеваний ассоциированных с H.pylori , М. 1998. - с.8-10.
9. Сапожников В.Г. Эхографические критерии патологии органов гастродуоденальной зоны у детей.: Дис... докт. мед. наук.- Витебск.- 1992.- 390 с.
10. Barthel J.S.; Everett E.D.//Diagnosis of campylobacter pylori infection: the “gold standard” and the alternatives. - Rev.Inf. Dis.- 1990.- v.12.- Suppl.1.- p.107-114
11. Cartun R.W.; Pedrsen C.A.; Krzymowski G.A.; Berman N.N. //Immunocytocemical detection of H.pylori formalin fixed tissue biopsy specimens. / J.Clin.Pathol.- 1990.- v.43.- p.518.
12. Cowen A. Infection and endoscopy: patient to patient transmition. In: Axon ATR, ed. Infection in Endoscopy. Gastrointestinal Endoscopy Clinics Of North America, Vol. 3(3). Philadelphia.- WB Saunders.-1993.-P.483-496.
13. Lee A.; Megraud F. // H.pylori: techniques for clinical diagnosis & basic research/ London.- 1996.- 305P.
14. Lopez D. M.; Elitsur Y. A study of Helicobacter-pylori in 100 pediatric patients from the Tri-State area.// W V Med J.- 1994.- Sep. 90(9).- P 367-369.
15. Reed AP. Endoscopy of the upper respiratory and upper gastrointestinal tract.// Mt Sinai J Med.-1995.- Jan. 62(1).- P. 1-2.
16. Simor A.E.; Cooter N.B.; Low D.E. // Comparison of four stains nd a urease test for rapid detection of H.pylori in gastric biopsies. / Eur.J.Clin.Microbial.Infect.Dis.- 1990.- v.9.-p.5.
© Copyright AMA Ltd. 2004.
Прямые методы основаны на обнаружении микроорганизмов с помощью гистологических, микробиологических или молекулярных способов. Непрямые методы регистрируют продукты жизнедеятельности микробов или различные активные соединения, образуемые макроорганизмом в ответ на инвазию H.pylori (антигены H.pylori, специфические АТ и пр.). Все используемые методики выявления хеликобактериоза имеют различную специфичность и чувствительность.
Большинство прямых методов в настоящее время основаны на инвазивных способах забора материала. Прямая диагностика инфекции H.pylori в настоящее время является достаточно трудоемким и отсроченным по времени процессом. Она включает себя проведение эзофагогастродуоденоскопии с взятием биоптатов слизистой оболочки для последующего исследования.
Эндоскопическое исследование органов пищеварения нельзя рассматривать только в качестве посреднического исследования для получения биоптатов слизистой. Эзофагогастродуоденоскопия имеет значительную самостоятельную диагностическую ценность. Во время ее проведения определяются достаточно специфические эндоскопические признаки, характерные для хеликобактерной инфекции. В частности к ним относятся: наличие язв в луковице двенадцатиперстной кишки, множественные разнокалиберные выбухания на стенках слизистой оболочки антрального отдела желудка, гиперемия слизистой оболочки, наличие мутной слизи в просвете желудка, отек и утолщение складок антрального отдела и тела желудка [12]
Чувствительность и специфичность отдельных признаков различна. Наиболее достоверными являются язвы луковицы двенадцатиперстной кишки (чувствительность и специфичность 100%) и наличие разнокалиберных выбуханий на стенках антрального отдела желудка (чувствительность 93%, специфичность 96%). Аналогичные данные позже были получены и другими исследователями, которые подчеркивают ведущее диагностическое значение выбуханий в антральном отделе, бывающими столь выраженными, что получили название “нодулярного гастрита”. При этом слизистая оболочка желудка приобретает характерную картину “булыжной мостовой” [14, 15].
Биоптаты слизистой оболочки желудка для проведения дальнейших исследований забираются из антрального отдела и тела желудка под контролем зрения. Обычно фрагменты слизистой оболочки берутся из антрального отдела по вершинам воображаемого равностороннего треугольника с привратником в центре, на расстоянии 2-4 см от него; из тела желудка по большой и малой кривизне и из свода желудка.
Морфологическое исследование биоптата слизистой оболочки с оценкой степени обсемененности позволяют достаточно достоверно определять H.pylori и являются своеобразным “золотым стандартом” при сравнении информативности различных способов диагностики хеликобактериоза [10]. Для выявления H.pylori на поверхности слизистой оболочки используют различные методики окраски срезов биоптатов. Наиболее часто используются окраски акридиновым оранжевым (чувствительность составляет 85%), методом Гимзы (79%), серебрением по Вартин-Старри (67%) [16]. Наиболее чувствительным, для обнаружения H.pylori, является иммуноцитохимический метод с моноклональными антителами и комплексом авидин биотин пероксидазы. Моноклональные АТ избирательно окрашивают только H.pylori, что значительно облегчает диагностику [11]. При изучении биоптатов выделяют три степени обсемененности СО H.pylori: 1.слабая - до 20 микробных тел в поле зрения (х630), 2.средняя - до 50 микробных тел в поле зрения, 3.- сильная - более 50 микробных тел в поле зрения, обозначаемые условными знаками (+-; ++; +++) [1]
Наибольшую информацию о H.pylori возможно получить только при выделении его из прижизненных биопсийных образцов. При использовании бактериологического метода возможно не только получение чистой культуры возбудителя, но и ее идентификация с дальнейшим изучением биологических свойств. Бактериологическое исследование незаменимо и при контроле лечения, когда количество бактерий в организме может быть настолько малым, что не определяется другими методами лабораторной диагностики [7].
В эпидемиологической практике выделение чистой культуры необходимо для внутривидового типирования штаммов H.pylori, что может быть использовано при мониторинге для дифференциации между реинфекцией новым штаммом и рецидивированием, обусловленным тем же штаммом. В научной практике бактериологический метод важен, так как позволяет изучать факторы патогенности H.pylori и изготовлять препараты для серологической диагностики. К недостаткам этого метода относятся, прежде всего, необходимость специального оборудования лаборатории и реактивов позволяющих выделять и идентифицировать H.pylori, а также обученных кадров специалистов. Все это сопряжено с большими материальными затратами [7].
Результаты исследования отсрочены от момента взятия биопсии минимум на 3-5 дней, рост чистой культуры на питательной среде обнаруживается, как правило, только при обострении заболевания и наличии выраженных визуальных признаков воспаления. Поскольку H.pylori очень чувствителен к условиям внешней среды и быстро погибает, необходимо строго соблюдать правила транспортировки биопсийного материала. Лучшей, на сегодняшний день средой, для транспортировки биопсийных образцов признана Pylori® (Bio-Merioux, Франция), которая способна стабильно поддерживать жизнеспособность чистой культуры H.pylori в течении 4-5 суток. Посев биопсийного материала производят не менее чем на 2 питательные среды (неселективную и селективную). Для культивирования и выделения H.pylori предложено достаточно большое количество неселективных питательных сред с 5-10% содержанием крови лошади или барана и агаром. Поскольку природная экологическая ниша H.pylori не является стерильной, то для выделения H.pylori из биоптатов лучше всего использовать селективные питательные среды, содержащие антибактериальные препараты, в состав которых включены ингибиторы роста кокковой, кишечной и грибковой микрофлоры. При культивировании H.pylori возникают определенные трудности, так как эти микроорганизмы микроаэрофилы и растут в особых условиях. Необходимую для культивирования атмосферу создают заполнением анаэростатов газовой смесью или с помощью коммерческих газогенерирующих пакетов. Оптимальный рост колоний наблюдают при рН среды от 6,7 до 8,0 при 32-39° С. Как правило на неселективной питательной среде H.pylori на 3-5 сутки формирует мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, росинчатые колонии диаметром 1-3 мм. На селективной питательной среде колонии H.pylori приобретают характерное золотисто-желтое окрашивание, за счет присутствующего в этой среде трифенилтетразолиумхлорида [13].
При получении роста колоний, по морфологии сходных с H.pylori, проводится их идентификация, которая включает в себя окраску мазка по и 3 биохимических теста - уреазный, каталазный и пероксидазный (все 3 теста положительные) [7].
Наиболее достоверным в диагностике H.pylori инфекции является использование полимеразной цепной реакции для идентификации этого микроорганизма. В настоящее время полностью расшифрована генная структура H.pylori. Проведение ПЦР позволяет обнаруживать в биоптатах СО генетический материал, специфичный для рода Нelicobacter (16S-рРНК) и вида Н.рylori (гены ureA, ureB, cagA, vacA и другие).
ПЦР, изобретенная Kary Mullis и улучшенная впоследствии другими исследователями, фундаментально изменила молекулярную биологию, открыв новые горизонты в медицинских и биологических науках. По своей мощности это новое биологическое исследование может быть сравнимо с открытием методов молекулярного клонирования приблизительно 25 лет назад. В основу ПЦР положена удивительно простая концепция, впервые предложенная 30 лет назад и очень напоминающая способ, посредством которого клетки дублируют свою ДНК in vivo. Цикл реакции составлен из трех этапов: денатурации (для полного разделения двух цепочек в ДНК молекулах); ренатурации (формирование комплекса между праймерами и целевой последовательностью); этап расширения (соединение праймера с цепочкой ДНК, удлиняясь с помощью полимераз). После денатурации две цепочки ДНК отделяются, и каждый праймер высвобождается для поиска комплементарной последовательности. В процессе охлаждения отжиг праймера к исследуемой области формирует устойчивый комплекс, который далее стабилизируется собственно полимеразой. В конце цикла в пробирке имеется вдвое большее количество ДНК по сравнению с первоначальным количеством. Затем цикл повторяется, и количество ДНК удваивается далее с каждым циклом. Эта амплификация совершается в геометрической прогрессии совершенно аналогично ядерной цепной реакции с двукратным, четырехкратным, восьмикратным, 16-кратным, 32-кратным, и т. д., увеличением при последующих циклах. После n циклов степень амплификации - соответственно 2n. Таким образом, после 10 циклов достигается 1024-кратная амплификация, а после 20 - 106-кратная [8].
В последнее время появилась возможность проводить ПЦР-диагностику по определенным участкам гена (в частности ureC) на основе высокоспецифичных для данного микроорганизма праймерами. Этот метод диагностики позволяет диагностироваить наличие H.pylori как в вегетативной, так и в кокковой форме. Более того, в последнее время появились отечественные разработки проведения ПЦР из образцов кала. Это позволит сделать метод ДНК-диагностики H.pylori неинвазивным, что существенно расширит спектр его применения в клинике [3].
Гистологические и микробиологические исследования, обладают высокой информативностью и достоверностью, но являются трудоемкими и достаточно длительными.
В связи с этим приобретает особую актуальность разработка новых диагностических экспресс-тестов и стандартизация признаков хеликобактериоза, выявляемых при различных исследованиях органов пищеварения.
Нами проводилась оценка эффективности нескольких видов экспресс-тестов для диагностики ПХ: промышленные наборы “CLO-test” фирмы “Delta” (Австралия), “Де-нол-тест” фирмы “Yamanouchi”(Япония) и лабораторные тесты “Campy-test”, разработанный под руководством проф. П.Я.Григорьева (1989), “Хеликотест”, предложенный к.б.н. В.Г.Жуховицким (1992) и быстрый уреазный тест, разработанный в ЦКБ МЦ УД Президента РФ.
Экспресс-диагностика пилорического хеликобактериоза основана на свойстве H.pylori - в огромном количестве (по сравнению с другими микробами) выделять уреазу, которая разлагает мочевину, входящую в состав диагностического теста, на углекислый газ и аммиак. В результате этого рН среды смещается в щелочную сторону и регистрируется по изменению окраски диагностикума. Время экспозиции после помещения биоптата в среду различно. Так, при выполнении CLO - теста и Campy-теста результат получали через 24 часа, проведение Хеликотеста позволяло сделать заключение о наличии Н.pylori в течение 2 часов. Самыми “быстрыми” тестами явились Де-нол тест и быстрый урезный тест, при которых результат оценивался в течение 5-20 мин.
Все экспресс-методы обладали разной чувствительностью и специфичностью (Таблица 1)
ТАБЛИЦА 1.
Сравнительная характеристика экспресс-тестов для диагностики H.pylori.
| Экспресс- тесты |
Чувствительность | специфичность |
| CLO-тест: | 95,1% | 100% |
| Campy-тест | 92,1% | 94,7% |
| Хеликотест | 96,3% | 100% |
| Де-Нол-тест | 96,8% | 100% |
| Быстрый уреазный тест |
96,5% | 100% |
Скорость изменения окраски экспресс-диагностикумов зависела от степени обсемененности слизистой оболочки микроорганизмами, которая подтверждалась последующим гистологическим исследованием. Наиболее выраженной эта закономерность прослеживалась при проведении Де-нол теста® и быстрого уреазного теста ЦКБ. При высокой степени обсемененности слизистой оболочки пилорическими хеликобактериями время изменения окраски этих диагностикумов не превышало 5 минут, если изменение цвета происходило в течение 5-15 минут, то степень обсемененности была преимущественно средней, а при низкой степени обсемененности реакция наступала через 15-30 минут. Если время реагирования теста превышало 30 минут, результат считался сомнительным.
Таким образом, все тесты обладали достаточно высоким уровнем чувствительности и специфичности. Для экспресс-диагностики на наличие пилорических хеликобактерий можно использовать любой из них, однако, предпочтение, по нашему мнению, следует отдавать Де-нол тесту или оригинальному, быстрому уреазному тесту ЦКБ, позволяющему не только быстро провести качественную реакцию, но и косвенно оценить степень обсемененности слизистой оболочки этими бактериями.
Проводимые нами уреазные экспресс-тесты достаточно информативны, но тем не менее они являются качественными реакциями, регистрирующими лишь продукты жизнедеятельности H.pylori. Потому в настоящее время продолжаются поиски экспресс-методов диагностики, позволяющих не только качественно, но и количественно оценить инфицированность СО пилорическими хеликобактериями.
В последнее время все большее значение в качестве диагностического метода оценки состояния полых органов ЖКТ получает их ультразвуковое cканирование. Этот способ, являясь неинвазивным, наряду с достаточно высокой информативностью позволяет длительно следить за состоянием внутренних органов в динамике.
Нами была предпринята попытка выявить диагностические признаки пилорического хеликобактериоза при ультразвуковом исследовании ВОПТ (натощак и после приема воды), проводимом параллельно с ЭГДС со взятием биопсии СО желудка.
Такие ультразвуковые признаки как большое количество жидкости в просвете желудка натощак (более 30 мл), повышенная толщина стенок (более 4 мм), смазанность внутреннего контура СО и нечеткая слоистость стенок желудка коррелируют с наличием в желудке H. pylori (р < 0,05) и служат ориентировочными маркерами хеликобактерной инфекции при ультразвуковом исследовании. Аналогичные данные были получены и другими исследователями при изучении пилорического хеликобактериоза [2, 5, 9].
Таким образом, метод ультразвукового сканирования полых органов ВОПТ может использоваться для дополнительного динамического наблюдения за состоянием СО при диагностике детей, инфицированных H. pylori.
В последнее время, наряду с разработкой более чувствительных и специфичных методов выявления H.pylori и продуктов их жизнедеятельности в биоптатае СО, все большее распространенеие получают неинвазивные методы диагностики.
Европейской и Российской группой по изучению H.pylori в 1998 году были приняты диагностические алгоритмы, определяющие проведение первичной диагностки инфекции H.pylori неинвазивными методами.
Дыхательный тест с меченными атомами 13С стал стандартным исследованием во многих странах Европы.
Для быстрой диагностики H.pylori с достаточно высокой степень специфичности (98%) в последнее время широко используются иммунологические методики, основанные на определении АТ к H.pylori в каппилярной крови (в России зарегестрированы тесты FastRead H.pylori®, (CQI-biomed) и Pyloriset® Dry (Orion Diagnostica). Преимуществом таких методик является простота их выполнения и быстрота получаемого результата. К недостаткам следует отнести невозможность использовать их для контроля за эрадикацией.
Другим неинвазивным методом диагностики H.pylori является ИФА. Эти методики становятся не только качественным диагностикумом, но с помощью них появляется возможным проводить количественное определение степени инвазии H.pylori, а также степень эрадикации [4]. ИФА позволяет определять антиген H.pylori с высокой степенью чувствительности в фекалиях больного. Этот метод становится все более распространенным в странах Европы и Америки несмотря на его высокую стоимость, аналогичную с дыхательным тестом [6].
21 апреля 1997 г., в Москве, на научной конференции посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР В.Х. Василенко “Язвенная болезнь и рак желудка. Новые взгляды в эру Helicobacter pylori”, были приняты рекомендации по диагностике и лечению инфекции H.pylori, разработанные Российской группой по изучению H.pylori (RHPSG) 9-10 мая 1998 года Европейское Гастроэнтерологическое Общество (ESPCG) разработало и утвердило рекомендации по диагностике и лечению инфекции H.pylori. Однако принятые “Рекомендации” относятся, к сожалению, только к взрослым больным.
Исключительное значение инфекции H.pylori в развитии заболеваний ЖКТ срeди детей разного возраста свидетельствует о необходимости разработки “Рекомендаций” по диагностике и лечению заболеваний, ассоциированных с H.pylori.
В 1997 году вышел в свет “Проект согласованных рекомендаций по диагностике и лечению Helicobacter pylori - ассоциированного гастрита и язвенной болезни у детей” (Российский вестник перинатологии и педиатрии, 1997-№6,-С.56-58). За прошедшее время появились новые методики и схемы, позволяющие своевременно и эффективно диагностировать и проводить лечение H.pylori-инфекции. В связи с этим назрела необходимость их пересмотра.
Во время проведения IV Российской Гастроэнтерологической Недели в Москве, на заседании Детской секции были обсуждены и приняты
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ ИНФЕКЦИИ HELICOBACTER PYLORI У ДЕТЕЙ.
Диагностика инфекции H.pylori
Первичная диагностика
Диагностика инфекции H.pylori осуществляется методами, позволяющими выявить микроорганизм или признаки его жизнедеятельности в организме больного Для первичной диагностики следует как можно шире использовать неинвазивные методы:
1. Обнаружение специфических антихеликобактерных АТ классов А и G в крови больного (иммуноферментный анализ, экспресс-тесты на основе реакции преципитации или иммуноцитохимиии с использованием каппилярной крови больных
2. Дыхательные тесты с регистрацией продуктов жизнедеятельности H.pylori (углекислый газ, аммиак)
3. ПЦР в анализах кала, слюны, зубном налете.
Инвазивные методы диагностики все меньше используются для первичной диагностики, в то же время сохраняют свою актуальность для контроля за эрадикацией. Под эрадикацией понимается полное уничтожение микроорганизма, определяемое через 6 недель после проведенного лечения. Диагностика эрадикации должна осуществляться как минимум двумя способами. В настоящее время проводится разработка тестов и методов неинвазивного контроля за эрадикацией. При диагностике эрадикации инвазивным методами необходимо исследовать фрагмент слизистой оболочки антрального отдела желудка и фрагмент фундального отдела желудка.
1. Эндоскопическое исследование с визуальной оценкой состояния слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки
2. Морфологический - определение микроорганизмов в препарате слизистой оболочки при специальных окрасках ( по Гимзе, толлуидиновым синим, Генте, Вартину-Старри)
3. Бактериологический - определение штамма микроорганизма, выявление его чувствительности к применяемым препаратам
4. ПЦР слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки.
Список литературы.
1. Аруин Л.И.; Смотрова И.А.; Ильченко А.А. / Campylobacter pyloridis при язвенной болезни.- // Арх.пат.. - 1988.- №2.- с.13-18.
2. Ганган В.С. Эхографические изменения желудка, двенадцатиперстной кишки и пищевода при хронической гастродуоденальной патологии у детей : Автореф. дис... канд. мед. наук.- М.1994.- 24с.
3. Гущин А.Е.; Туркин П.С.; Говорун В.М.// “Хеликопол-2” - диагностическая система для определения H.pylori на основе ПЦР/ в кн. Диагностика и лечение заболеваний ассоциированных с H.pylori , М. 1999. - с.19.
4. Дурова О.М., Исаков В.А., Иваненко Т.В. и др. // Непрямой иммуноферментный анализ для определения эрадикации H.pylori: предварительные результаты сравнительного исследования./ в кн. Диагностика и лечение заболеваний ассоциированных с H.pylori , М. 1999. - с60-61.
5. Заблодский А.Н. Эндоскопически-эхографические параллели в диагностике заболеваний гастродуоденальной зоны у детей : Автореф. дис... канд. мед. наук.- Минск.- 1996.- 16 с.
6. Исаков В.А. // Новые технологии в диагностике H.pylori / в кн. Диагностика и лечение заболеваний ассоциированных с H.pylori , М. 1999. - с.12-14.
7. Кудрявцева Л.В Изучение диагностической ценности различных методов диагностики хеликобактериоза. Дисс. Канд.мед. наук.// М.1999. - 154.С.
8. Пасечников В.Д./ Полимеразная цепная реакция в диагностике H.pylori -ассоциированных заболеваний.// в кн. Диагностика и лечение заболеваний ассоциированных с H.pylori , М. 1998. - с.8-10.
9. Сапожников В.Г. Эхографические критерии патологии органов гастродуоденальной зоны у детей.: Дис... докт. мед. наук.- Витебск.- 1992.- 390 с.
10. Barthel J.S.; Everett E.D.//Diagnosis of campylobacter pylori infection: the “gold standard” and the alternatives. - Rev.Inf. Dis.- 1990.- v.12.- Suppl.1.- p.107-114
11. Cartun R.W.; Pedrsen C.A.; Krzymowski G.A.; Berman N.N. //Immunocytocemical detection of H.pylori formalin fixed tissue biopsy specimens. / J.Clin.Pathol.- 1990.- v.43.- p.518.
12. Cowen A. Infection and endoscopy: patient to patient transmition. In: Axon ATR, ed. Infection in Endoscopy. Gastrointestinal Endoscopy Clinics Of North America, Vol. 3(3). Philadelphia.- WB Saunders.-1993.-P.483-496.
13. Lee A.; Megraud F. // H.pylori: techniques for clinical diagnosis & basic research/ London.- 1996.- 305P.
14. Lopez D. M.; Elitsur Y. A study of Helicobacter-pylori in 100 pediatric patients from the Tri-State area.// W V Med J.- 1994.- Sep. 90(9).- P 367-369.
15. Reed AP. Endoscopy of the upper respiratory and upper gastrointestinal tract.// Mt Sinai J Med.-1995.- Jan. 62(1).- P. 1-2.
16. Simor A.E.; Cooter N.B.; Low D.E. // Comparison of four stains nd a urease test for rapid detection of H.pylori in gastric biopsies. / Eur.J.Clin.Microbial.Infect.Dis.- 1990.- v.9.-p.5.
© Copyright AMA Ltd. 2004.