home
 

Уреазная система Helicobacter pylori [The urease system of Helicobacter pylori]

из кн. Helicobacter pylori. Basic Mechanisms to Clinical Cure R.H. Hunt, G.N.J. Tytgat Материалы симпозиума в Бермудах, организованного AXCAN PHARMA 26-29 Марта 2000 KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, Dordrecht / Boston / London 2000, p.15-25.

D.C. Weeks, D.R. Scott, P. Volland, E.A. Marcus, C. Athmann, K. Melchers, G. Sachs

Среда обитания желудочного Helicobacter spp.

Заселение желудков человека и других млекопитающих бактериями вида Helicobacter требует специального пояснения, так как все эти бактерии - ГРАМнегативные нейтралофилы. Практически всегда гастрит, т.е. воспаление желудка, возникает в результате инвазии НР, при этом только в 20% случаев наблюдаются характерные признаки язвенной болезни желудочно-кишечного тракта. Бактерии заселяют обычно антральный и фундальный отделы желудка, а также переходную зону.

Известно, что микроорганизм Helicobacter pylori постоянно синтезирует фермент уреазу, направляя до 15% усилий по синтезу протеинов на его производство (Scott D.R. et.al., 1998). Такой уровень продуцирования уреазы выше, чем у любой другой бактерии, что обусловлено важностью этого процесса для обеспечения выживания НР.

Это предположение было многократно подтверждено на животных моделях, когда инфицирование мышей, хорьков и свиней сопровождалось повышением уреазной активности (Tsuda M. et al., 1994, Andrutis K.A. et al., 1995, Eaton K.A. et al., 1991). Пока не совсем понятно, связана ли эта потребность в уреазе с колонизацией, или также и с инфицированием.

В вопросе о кислотности среды обитания бактерии исследователи не пришли пока к единому мнению. Одни полагают, что существует значительный градиент рН от желудочного содержимого до поверхности слизистой оболочки (Schade C., Flemstrom G., Holm L., 1994). При рН содержимого около 2.0 рН поверхности эпителия клетки может быть на уровне 6.0. Эти цифры получены при измерении поверхностного рН с использованием рН-микроэлектродов с открытым кончиком. Однако другие методы, такие как, например, конфокальная микроскопия с использованием рН-чувствительных флуоресцентных красителей, не показывают такого градиента рН (Chu S., 1999).

В то же время даже микроэлектроды показывают, что градиент рН пропадает, если желудочное содержимое имеет рН<2.0 и среднее за 24 часа внутрижелудочное рН в человеческом желудке имеет величину порядка 1.4. Это означает, что Helicobacter pylori должен быть способен существовать в высококислотной окружающей среде, а не при весьма близких к нейтральным значениям рН на поверхности желудка.

Кислотная активация внутрибактериальной уреазы.

Значение рН, при котором Н.pylori колонизирует желудок, соотносится со значением рН, при котором его фермент уреаза работает наилучшим образом или вообще способен работать. Оптимум рН уреазы, продуцируемой желудочными Helicobacter, - нейтральный, т.е. уреаза имеет высокую активость при рН 7.5 - 8.5 и отсутствие активности при рН<4.5.

Выяснилось, что данный фермент присутствует как внутри бактериальной клетки, так и на ее поверхности. Количество поверхностной уреазы значительно меньше внутрибактериальной; способ появления энзима на поверхности является в настоящее время предметом оживленной дискуссии (Phadnis S.H. et al., 1996; Vanet A, Labigne A., 1998). По одной гипотезе наличие уреазы обусловлено секрецией, по другой - клеточным лизисом. Однако представить реальный механизм выведения наружу с помощью секреции не только всех шести составляющих генного кластера уреазы и атома никеля, но и образование из них активного фермента, довольно трудно (Alm R.A., Trust T. J., 1999; Odenbreit S. et al., 2000). Поэтому гипотеза о лизисном происхождении поверхностной уреазы приобретает все больше сторонников (Marcus E.A., Scott D.R., 2001; Weeks D.L., 2000).

Уреаза, находящаяся на поверхности бактерии, не обладает активностью при рН ниже 4.5, поэтому не может обеспечивать сопротивление кислотности окружающей клетку среды. Функция, выполняемая поверхностной уреазой, пока не вполне определена. Возможно, ее присутствие препятствует или уменьшает появление дополнительной желудочной инфекции или предотвращает более мощный антигенный ответ.

По-видимому, сопротивляемость кислотности желудка осуществляет уреаза, находящаяся внутри микроорганизма. Если это так, то внутрибактериальная уреаза должна обладать уреазной активностью в кислой среде для генерирования нейтрализующего аммиака NH3, который будет образовывать NH4+ в кислоте.

В отличие от поверхностной или свободной уреазы, внутрибактериальная уреаза проявляет низкую активность при нейтральном рН, быстрое увеличение между рН 6.0 и 5.0 и затем равномерное ее снижение до рН 2.5 c остающейся даже при рН 2.0 некоторой активности. Активность измерялась по выделению 14СО2 из меченой мочевины и по скорости защелачивания при различных значениях рН на микрофизиометре (Scott D.R. et.al., 1998; Rectorschek M., 1998).

При значениях рН между 6.5 и 5.5 наблюдается 10-кратная активация уреазы. Возможно, действительная степень активации еще выше, так как измерения рН с помощью микрофизиометра с малым содержанием буфера показывают величину, близкую к 20-кратной.

Буферное действие внутрибактериальной уреазы на периплазм.

Зависимость активности внутрибактериальной уреазы от величины рН показывает, что неповрежденная бактерия способна генерировать NH3 в кислой среде, а именно это необходимо для противостояния желудочной кислотности. Концентрация мочевины в нормальном желудочном соке - около 1 - 2 мМ. Мочевина (карбамид) находится там благодаря диффузии через эпителий, при этом мочевине не требуются специальные носители, аналогичные найденным в почках или красных кровяных клетках (Hediger M.A., 1996). Желудочный сок может содержать до 100 мМ HCl; 1 мМ мочевины, независимо от того, насколько эффективно она будет утилизирована, недостаточно, чтобы противостоять этой кислотности, если пытаться сделать это во внешней окружающей среде. Однако, периплазм, который лежит между внутренней и внешней мембраной этой Грам-негативной бактерии, имеет очень маленький объем, порядка доли фемтолитра, и имеет некоторую степень защиты от кислоты благодаря наружной мембране и клеточной стенке. Периплазм к тому же является первым внешним по отношению к цитоплазме пространством, где появится NH3, продуцированный в клетке. Поэтому именно периплазм оказывается той областью, где аммиак, генерированный внутрибактериально, имеет возможность обеспечить сопротивление желудочной кислоте. В литературе приводятся два способа доказательства этого: прямой и косвенный.

Мембранный потенциал сквозь внутреннюю мембрану является функцией градиента рН между периплазмом и цитоплазмой. По мере того как периплазм становится более кислым, увеличивая рН-градиент по отношению к цитоплазме, мембранный потенциал будет уменьшаться, обеспечивая постоянную движущую силу для потока протонов через синтазу АТФ. Это протонная движущая сила - биоэнергетическая основа жизни, и для выживания бактерии эта сила должна поддерживаться у нее на высоком уровне у (Kashket E.R., 1985).

У бактерии HP (Meyer-Rosberg K. et al., 1996) при рН 7.0 эта сила составляет в общем около -220 мВ (примерно 1,4 ед. рН внутри и -140 мВ снаружи). Такой уровень протонной движущей силы сохраняется в диапазоне рН между 4.0 и 8.0, и необратимо теряется при рН < 4,0 в отсутствие мочевины.

Однако при добавлении ~1 мМ мочевины между рН 3.0 и 5.0 потенциал быстро возрастает до постоянного значения ~ -100 мВ. Это происходит даже в присутствии сильного буфера (Scott D.R. et.al., 1998). Простейшее объяснение этого явления - забуферивание периплазма до рН~6,2 с помощью аммиака, генерированного внутрибактериальной уреазой. Эксперименты с уреазонегативными микроорганизмами показывают, что за реализацию такого эффекта отвечает именно фермент уреаза, а уменьшение сигнала при использовании высоких концентраций селективного ингибитора уреазы - фторофамида - подтверждает, что это именно внутриклеточная уреаза, а не поверхностная.

Meyer-Rosberg K. et al. (1996) помещали НР в рН-чувствительную камеру и измеряли величину рН этой камеры в стационарном состоянии в присутствии мочевины при различных начальных значениях рН. Бактерия в присутствии мочевины очень быстро увеличивает значение рН в камере до 6,2 при начальном значении рН между 3,0 и 5,5.

Прямое доказательство повышения значения периплазматического рН можно продемонстрировать, используя конфокальную микроскопию. НР, выращенная совместно с желудочной АГС, хорошо адгезирована и иммобилизирована, что позволяет осуществлять микроскопию с большим увеличением. Флуоресцентный рН-краситель, BCECF, проникает через внешнюю мембрану, которая содержит порины, но не может проникнуть через внутреннюю мембрану микроорганизма. Краситель сигнализирует о повышении рН увеличением флуоресценции и поэтому должен обозначить изменение рН периплазма при добавлении мочевины. Действительно, в статье Athmann C. et al., 2000 приведены фотографии, показывающие свечение периплазма. При микроскопии in vivo периплазм с увеличением рН очерчивается в ограниченном пространстве, в непосредственной близости к бактерии. Если бы это было снаружи, за внешней мембраной, контур периплазматического пространства не был бы так хорошо выделен из-за быстрой диффузии NH3 в раствор.

Начальное изменение рН при добавлении мочевины в кислой среде (при рН 5.5) происходит в периплазме, а затем - во внутренней среде живых микроорганизмов. При нейтральном значении рН нет таких изменений, что согласуется с невысокой активацией внутрибактериальной уреазы при этих значениях рН.

Данные Athmann C. et al. показывают, что бактериальные клетки действительно забуферивают в первую очередь периплазматическое пространство при кислых значениях рН, используя внутрибактериальную уреазную активность. Это не происходит в ureI-негативных микроорганизмах. Если в систему добавить детергент, который нарушает проницаемость мембраны и позволяет BCECF проникать в цитоплазм, то в таком случае добавление мочевины приводит к защелачиванию цитоплазмы, и флуоресцентное свечение наблюдается уже по всей клетке.

Кинетический механизм активации

Активация уреазы внутри Н.pylori происходит при рН около 6,0. Кажущаяся константа Михаэлиса Км,арр свободной уреазы равна 0,7 мМ. В неповрежденной бактерии при нейтральном рН Км,арр - более 200 мМ, т.е реакция ферментативного гидролиза протекает почти в 300 раз медленней. Это показывает, что существует ограничение внутрибактериальной уреазной активности. Скорее всего имеет место ненасыщаемый процесс, такой как диффузия мочевины через внутреннюю мембрану. При кислых рН, когда реализуется полная активность уреазы, значение Км,арр становится равным константе Михаэлиса свободной уреазы, т.е. 0,7 мМ. Ограничение на внутрибактериальную активность исчезает. Самое простое объяснение такого кинетического поведения внутрибактериальной уреазы - это что проницаемость внутренней мембраны микроорганизма для мочевины возрастает при кислых рН. При нейтральных рН уреазная активность ограничена медленным проникновением мочевины, концентрация мочевины внутри бактерии никогда не достигает значений, близких к уровню Км,арр, за исключением очень высоких и нефизиологических концентраций. В кислой среде проницаемость внутренней мембраны для мочевины возрастает, скорость поступления карбамида из внешней среды (т.е. среды макроорганизма) настолько велика, что позволяет увеличивать уреазную активность. Очевидно, это эффективный механизм для разблокирования доступа мочевины к внутрибактериальной уреазе.

UreI

Генный кластер НР образуют семь генов Два из них, ureA и ureB, кодируют структурные субъединицы. Они образуют димер, которому для образования активной уреазы требуется вставка Ni2+ (Mobley H.L., 1995)

Это осуществляется согласованными действиями четырех участвующих в этом генов, три из которых необходимы для синтеза активной уреазы. Эти гены ureE, F, G, H ассоциированы парами. Как показано с помощью двухгибридного дрожжевого анализа, Е образует пару с G и F - с H (Voland P., Sachs G., 2000). В дальнейшем UreE и UreH ассоциируют с UreB. После ureB в кластере находится активаторный отрезок, немедленно за которым следует ureI, а затем E,F,G,H.

Предполагается, что именно ureI принимает участие в механизме регулирования течения мочевины через внутренннюю мембрану.

Для определения свойств ureI был проведен ряд экспериментов.

Во-первых, D.R.Scott и др. (2000) выделили данный протеин во всех желудочных бактериях вида Helicobacter и не обнаружен ни в одной из нежелудочных Helicobacter, проверенных этой группой исследователей. Очевидно, ureI важен для обитания бактерии именно в желудке млекопитающих. Удаление ureI приводит к потере кислотной активации внутрибактериальной уреазы. Мутанты с удаленным ureI показывают нормальную уреазную активность в лизатах. Мутанты также неспособны выживать при рН < 4.0 даже в присутствии 2.5 М мочевины, в то время как нативные микроорганизмы делают это без труда. Это показывает, что ureI является важным элементом, обеспечивающим выживание микроорганизма в кислой среде и что мочевина при этом взаимодействует с ureI. По всей видимости, функцией ureI является активация транспортировки мочевины.

Skouloubris S. et al. (1998) в своей работе по транскрипции/трансляции уреазы in vitro показали, что белок имеет шесть «вшитых» в мембрану сегментов.

Скорость доступа мочевины к бактериальной цитоплазме, необходимая для обеспечения высокой уреазной активности, может быть достигнута путем размещения канала для мочевины во внутреннюю бактериальную мембрану. Только в этом случае внутриклеточная уреазная активность способна обеспечивать направленный внутрь градиент мочевины, требуемый для образования NH3 бактерией НР в кислой среде. Измерение транспортировки мочевины в неповрежденной бактериальной клетке без специального оборудования очень проблематично. Проницаемость, т.е. способность мочевины проникать через немодифицированный бислой при комнатной температуре, равна 4·10-6 см/с.

Исходя из величины соотношения площади поверхности к объему бактериальной клетки (размер бактерии примерно 2,5x0,5 µм; объем - 5.8·10-15 мл), можно предположить, что мочевина вступает в реакцию за доли секунды при пассивном распределении. Таким образом, высокая активность внутрибактериальная уреазы при адекватной скорости поступления мочевины делает ненужным расход энергии на аккумуляцию субстрата.

В качестве средства определения функции ureI были использованы ooциты Xenopus. Они имеют объем примерно в тысячу раз больший, чем бактерии Н.pylori, при соотношении объема к поверхности в несколько тысяч крат меньшем. Эти клетки были выбраны для выяснения механизма действия системы пассивной транспортировки, проявляемой бактерией. Измерялась транспортная функция по отношению к 14С-мочевине после введения РНК, кодирующей ureI. Поглощение мочевины определялось как функция рН. Данная зависимость имеет заметное сходство с зависимостью активности уреазы от величины рН. рН, при котором происходит 50% увеличение максимального поглощения, равно 6.0, т.е. имеет то же самое значение, что и рН стационарного состояния, достигаемого в периплазме при добавлении мочевины в кислой среде (Rectorschek M., 1998).

Данное значение перехода рН наводит на мысль, что существуют один или более гистидинов, которые должны быть протонированы для активации транспортировки мочевины. Изменение гистидинов в первой периплазматической петле не повлияло на транспортировку мочевины в ооциты при кислых значениях рН, в то время как изменение терминального гистидина и двух гистидинов во второй периплазматической петле уничтожило ее кислотную активацию. Эта вторая петля, следовательно, является частью «ворот», которые открываются на протонирование гистидинов.

Транспортировка мочевины при кислых значениях рН не зависим от температуры и ненасыщаем. Это означает, что после активации не происходит фактического изменения или специфического взаимодействия мочевины со стенками поры. Согласно D.L.Weeks, D.R.Scott, P.Voland, E.A.Marcus, Cathmann, K. Melchers, G.Sachs, 2000, ureI демонстрирует свойства канала для поступления в клетку мочевины, который открывается протоном. Свойства ureI приведены в табл.1.

ТАБЛИЦА 1
Свойства ureI

Белок внутренней мембраны бактерии с шестью мембранными сегментами.

Селективный по отношению к мочевине, ненасыщаемый, не зависящий от температуры.

Кислотно-активируемый с рН50 = 6.2.

Канал для транспорта мочевины, открываемый протоном.

Срабатывание благодаря протонированию гистидина во второй петле.

Ускоряет поступление мочевины в кислой среде в 300 раз.

Дает возможность функционировать внутрибактериальной уреазе в кислой среде.

Предотвращает защелачивание при нейтральных рН.

Допускает колонизацию желудка при 1 ммоль/л мочевины

Уникальный олигомерный амидопорин


Существует предварительные доказательства того, что ureI является олигомером, возможно, димером или более высокой формой. В настоящее время изучаются вопросы о стуктуре и функции ureI как переносчика мочевины. Вероятно также, что он осуществляет транспортировку наружу NH3, помогая те самым предотвратить защелачивание цитоплазмы (Scott D.R., Marcus E.A.., Sachs G., 2000).

Данный протеин гомологичен предполагаемым амидным переносчикам (Chebrou H., Bigey F., Arnaud A., Galzy P., 1996). Однако, похоже, что ureI является уникальным белком, способным транспортировать только мочевину, а не такие с ней сходные по свойствам вещества, как тиомочевина, формамид или маннитол. Его следует рассматривать как члена семейства амидопоринов по аналогии с аквапоринами, которые, как известно, присутствуют в E.coli.

С выяснением механизма действия ureI связывают надежды на возможность открытия блестящих фармацевтических перспектив. Данный протеин может стать уникальной целью для монотерапевтической эрадикации НР. Ингибирование процесса транспортировки мочевины при рН < 4.0 должно быстро стать летальным для бактерии НР. Лекарственное средство такого рода будет иметь то преимущество, что ему не нужно будет проникать через внутреннюю мембрану бактерии.