home
 

Роль кокковых форм Helicobacter pylori в патогенетических механизмах и персистенции хеликобактерной инфекции

«Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии», 2001, №2, Приложение №13, Т.XI, с.99.

C.Г. Хомерики, И.А. Морозов, Больница Пущинского научного центра РАН, МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского

Способность к трансформации из спиралевидных в кокковые формы является одним из важнейших, но далеко не эксклюзивных свойств Helicobacter pylori (HP). Такой же способностью обладают и родственные виды микроорганизмов (15, 22). Считается, что эта способность помогает бактериям выживать во внешней среде (4). Существуют экспериментальные данные, подтверждающие возможность культивирования НР из кокковых форм, находившихся в речной воде более одного года (27). Дольше всего кокковые формы сохраняются в изотонической среде при температуре ниже 150С, тогда как при t=370C они быстро теряют жизнеспособность (19).

Инициирующими факторами трансформации НР из спиралевидных форм в кокковые во внешней среде могут быть физические факторы: повышенная инсоляция, низкая влажность, отсутствие пищевых субстратов (6, 24). В условиях бактериологического культивирования трансформация в кокковые формы происходит из-за истощения адекватных компонентов питательной среды (17, 24), а в организме человека вследствие изменений условий среды обитания под воздействием антисекреторных и антибактериальных препаратов. В слизистой оболочке желудка у нелеченых пациентов инициаторами образования кокковых форм могут служить активные формы кислорода, вырабатываемые фагоцитами, либо самим НР в присутствии специфических пиридиннуклеотидов.

Спиралевидная форма НР представляет собой микроорганизм, построенный из мелкозернистого протоплазматического матрикса, окруженного цитоплазматической мембраной и располагающегося в перипластическом пространстве, которое отграничено от окружающей среды клеточной стенкой, покрытой снаружи слоем липополисахаридов. Размеры спиралевидных форм 3 х 0,7 мкм. На одном из полюсов расположены длинные жгутики.

Начальная стадия трансформации в кокковую форму сопровождается конденсацией протоплазматического матрикса и увеличением перипластического пространства на одном из полюсов бактериальной клетки (обычно на полюсе, противоположном базальному комплексу жгутиков). Увеличение объема перипластического пространства приводит к растяжению клеточной стенки и оттеснению протоплазматического матрикса на периферию с образованием С-образных или U-образных форм. Эти формы являются промежуточным звеном между спиралевидными и кокковыми формами бактерий. Полностью сформировавшиеся кокковые формы сохраняют основную схему строения бактериальной клетки, и характеризуются четко выраженной клеточной стенкой, перипластическим пространством и цитоплазматической мембраной. Размеры сформировавшихся кокковых форм варьируют. В многодневных культурах на плотных средах преобладают клетки диаметром 3-4 мкм с гомогенным мелкозернистым протоплазматическим матриксом. Встречаются более мелкие клетки диаметром 1-2 мкм с конденсированным протоплазматическим матриксом и крупными электроноплотными глыбчатыми включениями в матриксе. Количество кокковых форм нарастает с увеличением времени культивирования. В 3-х дневной культуре при газонном способе посева преобладают спиралевидные формы, к 6-му дню около половины бактерий представлено кокковыми формами (3, 6, 20, 27). Трехмесячные кокковые формы имеют сохранную клеточную стенку, мембрану и цитоплазму (12).

В настоящее время нет достаточно веских оснований для того, чтобы связать определенный морфологический тип кокковых форм НР с функциональными характеристиками жизнеспособности и культивируемости (4). Наряду с жизнеспособными и культивируемыми часто встречаются жизнеспособные, но некультивируемые кокковые формы (7). Ранние стадии коккоподобных форм сохраняют жгутики и подвижность, аналогичную спиральным формам (4, 16), а также полярную мембрану, ассоциированную с базальным комплексом жгутиков. Эксперименты на гнотобионтах показали что неподвижные или малоподвижные штаммы НР менее вирулентны, чем подвижные штаммы (11). Лишь небольшое количество кокковых форм НР обладает полным набором жгутиков и сохраняет метаболическую активность, обеспечивающую их подвижность, сравнимую к таковой у спиралевидных форм.

Существует серия доказательств жизнеспособности кокковых форм НР. Биохимическими методами установлено, что в культурах, состоящих из кокковых форм, в течение нескольких месяцев сохраняется такой же уровень окислительного метаболизма, как и в культуре из спиралевидных форм (12). В них сохраняется высокий уровень щелочной и кислой фосфатаз (13), а также стабильный уровень АТФ, который увеличивается, если в старую культуру добавить некоторое количество свежей питательной среды (2). Включение бромдиоксиуридиновой метки в кокковые формы свидетельствует о продолжающемся в них синтезе новой ДНК (4).

НР синтезирует различные ферменты и белки, чтобы защитить себя и выжить в условиях агрессивной внешней среды. Более 15 % белкового синтеза микроорганизма приходится на уреазу, которая является конституциональным ферментом необходимым для колонизации слизистой оболочки желудка. В присутствии мочевины он способствует выживаемости микроорганизма при низких значениях рН (18, 22). При отсутствии в среде мочевины НР быстро теряет жизнеспособность в условиях кислой среды (18). Уреаза-негативные штаммы НР неспособны к колонизации слизистой оболочки желудка гнотобионтных животных (10). Содержание уреазы в кокковых формах НР снижено на 40 % по сравнению со спиралевидными формами (21). Несмотря на то, что при трансформации в кокковые формы НР возможна утрата уреазной активности, в них посредством полимеразной цепной реакции продолжают выявляться гены, кодирующие уреазу (белок 26-kDa) (13).

Слабо кислая среда (значения рН от 5 до 3,5) является фактором, активирующим процессы белкового синтеза в НР. Некоторые из белков НР, в частности белок теплового шока, обладают трофическим действием на сами микроорганизмы и способны вызывать в них перестройку клеточного цитоскелета, что может быть инициирующим моментом для обратной трансформации кокковых форм в спиралевидные формы. Интересно, что одни и те же значения кислого рН, при действии на кокковые и спиралевидные формы, вызывают в них синтез различных белков (3, 19).

Сильно кислая среда (рН<3) является губительной для НР, при этом кокковые формы НР проявляют гораздо меньшую устойчивость к низким значениям рН по сравнению со спиралевидными формами. Так уже через 15 минут инкубации при рН 2 кокковые формы теряют свойство культивируемости, тогда как спиралевидные формы выдерживают 30-минутную инкубацию в этих условиях (20).

Минимизация активности ферментного и энергетического метаболизма в кокковых формах НР носит, вероятно, приспособительный характер и указывает на сохранение жизнеспособности микроорганизмов (4, 15). Это подтверждается и тем, что кокковые формы НР могут быть обнаружены посредством окрашивания акридиновым оранжевым (5).

Кокковые формы НР в меньшей степени стимулируют высвобождение интерлейкина-8 из культуры желудочных эпителиоцитов, по сравнению со спиралевидными формами (9). Воспалительный ответ такого уровня может быть достигнут и при пассивной иммунизации с мертвыми организмами. Тем не менее, установлено, что при пероральном введении как спиралевидные, так и кокковые формы в равной степени обладают инвазивностью и иммуногенностью для макроорганизма (25). Различия при этом касаются лишь сроков развития проявлений инфекции. При введении спиралевидных форм манифестация инфекции наблюдалась через 4 недели, а при введении кокковых форм - через 16 недель.

Как правило, большая часть микробных тел НР располагается свободно в слое желудочной слизи. Некоторые из них адгезируются к желудочным эпителиоцитам. Адгезия НР к клеточной мембране вызывает повреждение эпителиальных клеток слизистой оболочки желудка. Кокковые формы НР обнаруживаются в непосредственной близости к клеткам с более выраженными морфологическими изменениями, тогда как спиральные формы чаще располагаются в близости к неизмененным или менее поврежденным клеткам (14). Отмечается также преимущественное группирование кокковых форм в местах расположения слизистых клеток (3).

Кокковые формы также легко, как и спиралевидные, адгезируется к желудочным эпителиоцитам, вызывая те же морфологические изменения в местах прикрепления бактерий, в виде F-S перестройки актина в подмембранных участках цитоплазмы, где формируется тонковолокнистые конденсированные структуры (5, 23). Одним из основных факторов, определяющих степень повреждения слизистой оболочки желудка при хеликобактерией инфекции, является плотность колонизации - обсеменённость ее микроорганизмами (8). Изменения в эпителиальных клетках при прикреплении к ним НР сводятся к формированию пьедестала, слиянию и конденсации мембран, вакуолизации и интернализации (24, 22) Адгезия спиралевидных форм бактерий к эпителиоцитам или их интернализация клетками желудочного эпителия может и сама по себе служить инициирующим стимулом к трансформации НР из спиралевидных в кокковые формы. В случаях интернализации НР, расположенный внутри эпителиальных клеток, не способен к размножению и часто приобретает дегенеративные формы (23). Хронометраж динамики трансформации НР показывает, что спиралевидные формы трансформируются в кокковые через несколько часов после адгезии к поверхности желудочных клеток. Кокковые формы НР вызывают более раннюю и более сильную перестройку клеточного цитоскелета (23).

В слизистой оболочке желудка кокковые формы более часто и в большем количестве наблюдаются у больных раком желудка, нежели при язвенной болезни (8), что может свидетельствовать о более выраженных канцерогенных свойствах кокковых форм НР. Важность этого аспекта патогенеза хеликобактерной инфекции побудила нас проанализировать динамику обсеменённости слизистой оболочки желудка различными формами НР в процессе антихеликобактерного лечения.

С использованием метода мазков-отпечатков слизистой оболочки нами изучалась динамика обсеменённости антрального и фундального отделов желудка различными формами НР в процессе эрадикационной терапии у больных с язвенной болезнью. Обследовано 49 больных с язвенной болезнью, осложненной кровотечением. Средний возраст больных 43,3 года. Диагностика НР-инфекции осуществлялась с помощью быстрого уреазного теста, гистологического исследования биоптатов и мазков-отпечатков слизистой оболочки желудка с окраской по Грамму. Степень обсемененности слизистой оболочки оценивали по количеству микробных тел в поле зрения: низкая (20), средняя (20-50) и высокая (более 50) (1). Всем больным с подтвержденной HP-инфекцией была назначена стандартная семидневная эрадикационная терапия. Изучение динамики обсемененности слизистой оболочки в процессе курса лечения осуществлялось путем взятия биоптатов с изготовлением мазков-отпечатков при неоднократных контрольных эндоскопических исследованиях в первые трое суток, а затем на 8, 14, 21, 35 и 45 сутки. При ретроспективном анализе проведенной эрадикационной терапии больные были разделены на две группы. Первую группу составили больные с успешной эрадикацией (n = 33), вторую - больные, у которых эрадикации достичь не удалось (n=16).

Результаты исследования показали, что у всех больных до начала антибактериальной терапии в антральном отделе обнаруживалась средняя или высокая степень обсемененности слизистой оболочки спиралевидными формами НР, тогда как в слизистой оболочке тела желудка степень обсемененности была, как правило, низкой. Примерно у трети обследованных больных при первичной диагностике в слизистой оболочке фундального отдела желудка не удалось выявить присутствия НР. Через трое суток на фоне проводимого антибактериального лечения в антральном отделе обнаруживались граммотрицательные кокковые формы микроорганизма. В группе больных с успешной эрадикацией уже на 8 сутки ни в антральном ни в фундальном отделе желудка микроорганизмы не обнаруживались. В то же время в группе больных без эрадикации на 8 сутки кокковые формы НР обнаруживались в слизистой оболочке не только антрального, но и фундального отдела желудка. На 14 сутки, как в антральном отделе, так и в теле желудка у этих больных постоянно встречались спиралевидные формы НР, а на 21 сутки обсемененность ими слизистой оболочки желудка достигала средней и высокой степени.

Учитывая широкий спектр метаболических реакций, реализуемых микроорганизмами в ходе структурных трансформаций, существует возможность усиления патогенных свойств НР на отдельных этапах таких трансформаций. Имеются предварительные данные, указывающие на то, что именно в период трансформации спиралевидных форм НР в кокковые наблюдается максимальная активизация продукции ими активных форм кислорода. Различные конформационные типы неспиралевидных форм НР обладают особенностями метаболизма, направленными на повышение устойчивости микроорганизма к различным экзогенным, в том числе и к терапевтическим воздействиям.

Таким образом, результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что структурная трансформация спиралевидных форм НР в кокковые формы не всегда является признаком структурно-функциональной дезинтеграции микроорганизма. В ряде случаев кокковые формы сохраняют способность к обратной трансформации в спиралевидные формы. Структурная динамика реверсии кокковых форм не изучена, а инициирующие ее факторы неизвестны. Продолжение исследований в этом направлении может выявить новые важные аспекты патогенеза хеликобактерной инфекции и найти новые способы лечения заболеваний, ассоциированных с эти микроорганизмом.

ЛИТЕРАТУРА.
1. Аруин Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А., Яковенко Э.П. Хронический гастрит. Амстердам, 1993,362с.
2. Andersen L.P., Borland A., Karacan H., Colding H., Nilsson H.О., Wadstrom Т., Blom J. /Possible clinical importance of the transformation of Helicobacter pylori into coccoid forms. //Scand. J. Gastroenterol- 2000. -v.9. -p.897-903.
3. Benaissa M., Babin P, Quellard N., Pezennec L, Cenatiempo Y, Fauchere JL./Changes in Helicobacter pylori ultrastructure and antigens during conversion from the bacillary to the coccoid form. //Infect Immun. -1996. -v.64. -p.2331-5.
4. Bode G, Mauch F, Malfertheiner P. /The coccoid forms of Helicobacter pylori. Criteria for their viability. //Epidemiol Infect. -1993. -v.lll. -p.483-90.
5. Catrenich CE, Chestnut MH. /Character and origin of vacuoles induced in mammalian cells by the cytotoxin of Helicobacter pylori. //J Med Microbiol. -1992. -v.37. -p.389-95.
6. Catrenich CE, Makin KM. /Characterization of the morphologic conversion of Helicobacter pylori from bacillary to coccoid forms. //Scand J Gasttnenterol. -1991. -v.26. - Suppl 181. -p.58-64.
7. Cellini L, Allocati N, Angelucci D, lezzi T, Di-Campli E, Marzio L, et al. /Coccoid Helicobacter pylori not culturable in vitro reverts in mice.//Microbiol hwmunol. -1994. -v.38. -p.843-50.
8. Chan WY, Hui PK Leung KM, Chow J Kwok F, Ng C-S. /Coccoid forms of Helicobacter pylori in the human stomach. //Am J Clin Pathol. -1994. -v.102. -p.503-7.
9. Cole SP, Cirillo D Kagnoff MF, Guiney DG Eckmann L. /Coccoid and spiral Helicobacter pylori differ in their ability to adhere to gastric epithelial cells and induce interleukin-8. //Infect Immun. -1997. -v.65. -p.843-6.
10. Eaton KA, Brooks CL, Morgan DR, Krakowa S. /Essential role of urease in pathogenesis of gastritis induced by Helicobacter pylori in gnotobiotic piglets. //Infect Immun. -1991. v.59. -p.2470-5.
11. Eaton KA, Catrenich CE, Makin KM, Krakowka S. /Virulence of coccoid and bacillary forms of Helicobacter pylori in gnotobiotic piglets. //J Infect Dis. -1995. -v.171. -p.459-62.
12. Gribbon LT, Barer MR. /Oxidative metabolism in nonculturably Helicobacter pylori and Vibrio vulnificus cells studied by substrate-enhanced tetrazolium reduction and digital image processing. //Appl Environ Microbiol -1995. -v.61. -p.3379-84.
13. Hua J, Ho B. /Is the coccoid form of H. pylori viable? //Microbios. -1996. -v.87. -p.103-12.
14. Janas В Czkwianianc E, Bak-Romaniszyn L Bartel H, Tosik D, Planeta-Malecka I. /Electron microscopic study of association between coccoid forms of Helicobacter pylori and gastric epitheli-at cells. //Am J Gastroenterol. -1995. -v.90. -p.1829-33.
15. Jiesong H, Megraud F. /Evidence of the viability of non cultutable coccoidal forms of Helicobacter felis. //Gut. -1995. -v.37. -Suppl 1. -p.376.
16. Jones DM, Curry A, Fox AJ./An ultrastructural study of the gastric Campylobacter-like organism "Campylobacter pyloridis". //J Gen Microbiol. -1985. -v.131. -p.2335-1.
17. Kusters JG, Gerrits MM, Van Strijp JA Vandenbroucke-Grauls CM. /Coccoid fotms of Helicobacter pylori are the morphologic manifestation of cell death. //Infect Immun. -1997. -v.65. -p.3672-9.
18. Marshall BJ, Barret LJ, Prakash C, McCallum RW Guetrant RL. /Urea protects Helicobacter pylori from the bactericidal effect of acid. //Gastroenterology. -1990. -v.99. -p.697-702.
19. Mizogushi H, Fujioka T, Kishi K, Nishizono A, Kodama R Nasu M. /Diversity in protein synthesis and viability of Helicobacter pylori coccoid forms in response to various stimuli. //Infect Immun. -1998. -v.66. -p.5555-60.
20. Moshcowitz M, Corea A, Arber N, Konikoff F, Berger S Gilat T. /Morphological transformation of Helicobacter pylori during prolonged incubation: association with decreased acid resistance. //J Clin Pathol. -1994. -v.47. -p.172-4.
21. Nilius M, Strohle A, Bode G, Malfertheiner P. /Coccoid like forms (CLF) of Helicobacter pylori. Enzyme activity and antigenicity. //Int J Med Microbiol Viral Parasitol Infect Dis. -1993. -v.280. -p.259-72.
22. Noach LA, Rolf TM, Tytgat GN. /Electron microscopic study of association between Helicobacter pylori and gastric and duodenal mucosa. //J Clin Pathol. -1994. -v.47. -p.699-704.
23. Segal E, Falkow S, Thompkins LS. /Helicobacter pylori attachment to gastric cells induces cytoskeletal rearrangement and tyro-sine phosphorylation of host cell proteins. //Proc Natl Acad Sci.-1996. -v.93. -p.1259-64.
24. Sorberg M, Nilsson M, Hanberger H, Nilsson LE. /Morphologic conversion of Helicobacter pylori from baccilar to coccoid form. //Eur J Clin Microbiol Infect Dis. -1996. -v.15. -p.216-9.
25. Wang X, Sturegard E, Rupar R, Nilsson HO, Aleljung PA, Carlen B, et al. /Infection of BALB/cA mice by spiral and coccoid forms of Helicobacter pylori. //J Med Microbiol. -1997. -v.46. -p.657-3.
26. West AP, Millar MR, Tompkins DS. /Effect of physical environment on survival of Helicobacter pylori. //J Clin Pathol.- 1992. -v.45. -p.228-31.
27. West AP, Millar MR, Tompkins DS. /Survival of Helicobacter pylori in water and saline. //J Clin Pathol.-1990. -v.43. -p.609.
Измерение жизненных функций. Диагностический прибор холтер экг - пожалуй, лучшее решение. ; Divine Fortune ОХРЕНЕННО КРУТОЙ АППАРАТ спрекрасной графикой и хочу заметить не плохой